晚期非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞检测的临床意义

李 晶，姜 北，万 鹏，李 娜，王于理，巩 平

肺癌是严重威胁人类健康的疾病，其发病率呈逐年上升趋势，是目前病死率最高的恶性肿瘤，而患者死亡的主要原因是肿瘤的复发和远处转移[1-3]。血行播散是肺癌转移的重要途径，肿瘤细胞可以通过血液循环发生远处转移。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC) 是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞，与肿瘤血行转移密切相关，在肿瘤转移的环节中扮演重要角色[4]。本研究通过检测晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者化疗前后外周血CTC表达情况，分析其与临床特征、疗效的关系，探讨CTC预测晚期NSCLC化疗疗效的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年6月—2012年2月石河子大学医学院第一附属医院收治的晚期原发NSCLC患者30例为肺癌组，其中男17例，女13例；年龄 43～79岁,中位年龄 67岁。均经病理或活检证实为NSCLC，按2010年美国国立综合癌症网络(NCCN)NSCLC标准分为：ⅢA、ⅢB及Ⅳ期。入组前均未接受任何抗肿瘤治疗，预计生存期>3个月，依从性好。收集同期入院治疗的肺良性疾病及健康志愿者各10例为对照组，其中男11例，女9例；年龄34～68岁，中位年龄52岁。两组患者性别构成和年龄具有均衡性，均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；小鼠抗人细胞角蛋白(cytokeratin,AE1/AE3)单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素(fluoresce in isothiocyanate,FITC)标记羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)购自美国Sigma公司；肺腺癌A549细胞株为湖南湘雅医学院李彩霞老师惠赠。

1.3 实验步骤

1.3.1 标本采集 严格消毒后，应用真空采血针采取肘正中静脉血，弃去穿刺后的前2 ml，采集此后的7.5 ml静脉血。所有血样加入肝素抗凝混匀，并在采集后24 h内富集肿瘤细胞。

1.3.2 密度梯度离心法富集肿瘤细胞 取7.5 ml抗凝全血与等量磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，小心加至细胞分离液层面上(2∶1)；室温下2 000 r/min(离心半径16 cm)，离心20 min；吸取环状乳白色单核细胞层，加入5 ml PBS重复洗涤2次，室温下2 000 r/min(离心半径16 cm)，离心15 min。

1.3.3 免疫荧光法染色 将富集所得单个核细胞悬液均匀涂于载玻片上,室温下静置30 min后用4%多聚甲醛固定抗原10 min,PBS清洗5 min×3次(待玻片干燥后可置-80 ℃冰箱统一染色)；0.1%Triton X-100通透胞膜15 min(室温),PBS清洗5 min×3次；5%牛血清清蛋白(BSA)封闭30 min (37 ℃),PBS清洗5 min×3次；滴加小鼠抗人Pan-细胞角蛋白(CK) (1∶100),4 ℃过夜，PBS清洗5 min×3次，滴加 FITC标记羊抗小鼠 IgG (1∶100),室温下孵育2 h，PBS清洗5 min×3次；在细胞区加入7 μl DAPI染细胞核，最后加盖玻片封固。免疫荧光显微镜下观察、照相。以对数生长的肺腺癌A549细胞株为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。整个过程注意避光操作。

1.3.4 CTC阳性标准 (1)细胞呈圆形、椭圆形或长型，核质比较血细胞明显增大[5-7]；(2)同时染绿色(CK阳性)和蓝色 (DAPI阳性)荧光，荧光下细胞形态完整；(3)光镜下可见完整的细胞形态和细胞核。阴性对照：对照组外周血单个核细胞。由两人在荧光显微镜下分别观察细胞显色情况，按照以上标准采集阳性细胞图像，有分歧的细胞图像由两人共同判定结果。目前CTC阳性判定尚无国际化标准，本文以见到CTC即为阳性结果。

1.4 肺癌组疗效评价标准 肺癌组患者按规范行化疗，于化疗前及化疗2个周期结束后检测外周血CTC，每2个周期行全面检查及疗效评估。按照实体瘤疗效评价标准(RECIST)评价[8]，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)及进展(PD)；CTC数目评价疗效为7.5 ml 外周血中肿瘤细胞数目下降>1个为缓解(RR)、不变为SD、上升>1个为PD[9]。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计数资料比较采用Fisher确切概率法、配对设计的χ2检验及列联表分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC检测结果 对照组外周血中未检出肿瘤细胞，肺癌组患者外周血中18例(60%)检出肿瘤细胞；两组CTC阳性率比较，差异有统计学意义(P=0.001)。肺癌细胞株A549(阳性对照)经荧光染色，细胞内有绿色(胞质)及蓝色(胞核)荧光分布，肺癌细胞内有CK表达。

2.2 CTC与NSCLC患者临床特征的关系 CTC阳性与NSCLC患者年龄、性别、是否吸烟、组织学类型、分化程度均无关(P>0.05)；CTC阳性与NSCLC患者病理分期有关(P<0.05，见表1)。

表1 CTC阳性与NSCLC患者临床特征的关系〔n(%)〕

2.3 化疗前后CTC阳性率比较 化疗前检测CTC阳性18例，阳性率为60%；化疗后检测CTC阳性11例，阳性率为37%，化疗前后CTC阳性率比较，差异有统计学意义(P=0.016)。

2.4 CTC数目评价与RECIST评价对疗效的判定比较 化疗2个周期完成后进行疗效评价，CTC数目评价与RECIST评价疗效比较，差异无统计学意义(χ2=7.000,P>0.05)，且两种评价方法具有一定的吻合度(κ=0.557，见表2)。相关分析显示，CTC数目与临床疗效呈负相关(r=-0.434,P=0.017)。

表2 CTC数目评价与RECIST评价对疗效的判定比较(例)

Table2 Comparison of the evaluation of effect by CTC number and RECIST

CTC数目评价RECIST评价 PR SD PD 合计 RR5 3 0 8 SD016016PD2 2 2 6 合计721230

注：PR=部分缓解，SD=稳定，PD=进展，RR=缓解

3 讨论

密度梯度离心法具有价格低廉、操作简便、细胞回收率高等优点,是目前常用的CTC富集分离方法之一；免疫荧光法是最常用的CTC检测方法之一,二者结合可显著提高肿瘤细胞检测的敏感度。CK可作为评估肿瘤血行微转移的较敏感的指标，但以CK单一指标作为判断存在肿瘤细胞的标准，会产生假阳性结果。本研究结合细胞形态学分析,荧光显微镜下观察肿瘤细胞可进一步在光镜下获得病理学的支持，排除非特异染色细胞的干扰,使检测的特异度进一步增强。本研究采用密度梯度离心法联合免疫荧光法检测外周血中CK阳性的CTC，结果显示30例NSCLC患者外周血中18例检出肿瘤细胞，阳性率为60%，与文献报道[10-11]基本一致；20例对照者外周血中均未检出肿瘤细胞，说明本研究的检测方法具有较高的特异度。

肿瘤细胞进入外周血中形成 CTC 是肿瘤远处转移的前提[12]，虽然外周血中检测到肿瘤细胞并不意味着一定存在转移灶，但实验表明 CTC的存在与肿瘤患者的病理分期以及预后密切相关[13]。本研究结果显示CTC阳性与NSCLC患者年龄、性别、是否吸烟、组织学类型、分化程度均无关，但与病理分期有关；Ⅳ期NSCLC患者CTC阳性率明显高于ⅢA及ⅢB期，提示CTC阳性与远处转移密切相关,进一步证实CTC在远处转移病灶形成中起重要作用。Sher等[14]在其研究中也发现晚期肺癌患者CTC阳性率明显高于早期患者，且CTC可作为TNM分期系统的有利补充。本研究纳入的对象均为晚期NSCLC患者，研究样本有限，需要继续扩大样本量进一步验证CTC与肺癌患者临床特征的关系。

本研究中比较了30例NSCLC患者化疗前后CTC表达情况，治疗后CTC阳性率较治疗前降低，提示CTC与治疗相关。但本研究发现，2例持续PR患者仍可检测出CTC。虽然文献报道肿块的大小和重量与CTC多少有关[15]，但这种相关性会受到多种因素的影响，如肿瘤组织本身对周围血管的侵蚀力以及局部组织坏死分解的速度；所以，治疗后肺内病灶明显缩小的患者，由于肿瘤组织存在对微血管侵蚀和破坏的能力，此时脱落入循环的肿瘤细胞可形成微转移或是二次转移，因此化疗后为CR、PR的患者仍有可能检测出CTC。目前对于肿瘤细胞在循环中释放是随机还是具有周期性和规律性尚无明确定论，单独一次检查阴性不能排除瘤细胞脱落入血的可能性，因此多时间点、多次采集标本来检查CTC更为合理。

本研究30例NSCLC患者化疗2个周期后行CTC数目评价与RECIST评价对疗效进行评价，结果提示两种评价方法无差异，且两种评价方法具有一定的吻合度；相关分析表明，CTC数目与临床疗效呈负相关。以上结果显示，CTC与疗效有相关性，通过CTC数目可以预测晚期NSCLC患者的化疗疗效，相比RECIST评价更能反映患者病情的微观变化和肿瘤转移的特征，具有前瞻性、简便性和可重复性等优点，有利于NSCLC患者的个体化治疗。这与Cohen等[16]和Punnoose等[17]的研究结果相一致。Punnoose等在一项NSCLC的Ⅱ期临床试验中观察到，患者化疗后CTC水平较基线水平下降，并与18氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(18FDG-PET)影像学检查的结果吻合，这部分患者获得了较长的无肿瘤进展生存期，研究提示，CTC水平的下降可作为有效治疗应答的早期指标。对于治疗后CTC高水平的肺癌患者是否能从其他治疗方案中获益，需要更大规模的试验和临床研究来验证。

目前众多的研究显示CTC可以预测肿瘤的侵袭性，其存在提示患者预后较差。Wu等[10]认为CTC≥2个/7.5 ml组的非小细胞肺癌患者较CTC<2个/7.5 ml组的生存期更短。本研究时间较短，尚不能对入组患者预后进一步分析探讨，需长期随访后再进行统计学分析。总之，CTC在肺癌患者中具有巨大的潜在临床应用价值；随着这一研究领域的不断发展，将促进我们进一步深入了解CTC与肺癌复发转移的相关机制，为临床应用及肺癌个性化治疗提供新的方向。

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