非小细胞肺癌EGFR基因第一内含子（CA）n多态性与基因突变及预后的关系

王烈 乐涵波 何剑营 陈冬冬 续力云 刘晓光 张永奎 竺王玉

●诊治分析

非小细胞肺癌EGFR基因第一内含子（CA）n多态性与基因突变及预后的关系

王烈 乐涵波 何剑营 陈冬冬 续力云 刘晓光 张永奎 竺王玉

目的 研究非小细胞肺癌（NSCLC）患者表皮生长因子受体（EGFR）基因第一内含子（CA）n[intron 1（CA）n]多态性与EGFR基因突变的关系，并观察患者的预后。方法观察129例NSCLC患者生存情况，检测患者手术切除新鲜癌组织或石蜡包埋组织EGFR基因intron 1（CA）n及19、21外显子突变。结果129例NSCLC患者中，检出EGFR基因突变35例（27．1%），其中EGFR19外显子21例（16．3%），21外显子15例（11．6%）。EGFR intron 1（CA）n出现频率最多的等位基因为（CA）20（38．8%），其次为（CA）16（26．4%）。短（CA）n与EGFR基因突变有关，特别是19外显子突变，差异有统计学意义（均P＜0．05），但与21外显子突变无明显相关，差异无统计学意义（P＞0．05）。（CA）16与19外显子突变有关，差异有统计学意义（P＜0．05）。EGFR基因intron 1短（CA）n与长（CA）n NSCLC患者总生存时间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论EGFR第一内含子短（CA）n，特别是（CA）16重复序列可能是影响19外显子缺失突变的一个重要因素。（CA）n多态性不是NSCLC患者预后的危险因素（P＞0．05）。

非小细胞肺癌 表皮生长因子受体 单核苷酸多态性 基因突变

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the relationship among epidermal growth factor receptor(EGFR)gene intron 1(CA)n polymorphisms,gene mutations and prognosis in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)．MethodsThe EGFR gene intron 1(CA)n polymorphisms,exons 19 and 21 mutation in fresh tissue or paraffin-embedded tissue sections were amplified with PCR,followed by direct sequencing in 129 surgically-removed specimens of NSCLC．ResultsEGFR mutations were detected in 35 of 129(27．1%)patients with NSCLC．There were 21 cases(16．3%)with mutations in exon 19 and 15 cases(11．6%)with mutations in exon 21．EGFR intron 1(CA)n was occurred more frequently in(CA)20 allele(50/129,38．8%）,followed by(CA)16 allele (34/129,26．4%)．A genetic association was found between shorter CA alleles and EGFR mutations,especially exon 19 mutations (P＜0．05),but not exon 21 mutation(P＞0．05)．(CA)16 allele conferred high capability for retaining EGFR exon19 mutation(P＜0．05)．There was no significant difference in the overall survival time between patients with EGFR intron 1 short(CA)n polymorphisms and with long(CA)n polymorphisms(P＞0．05)．ConclusionEGFR intron1 short(CA)n，especially(CA)16 polymorphisms may be involved in the accumulation of the EGFR exon 19 deletions during lung cancer development and(CA)n polymorphisms may be not associated with the prognosis of patients with NSCLC．

近年来，表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶结构域体细胞突变的发现及其抑制剂的成功使用为肺癌患者治疗带来了新的希望。该突变90%为21外显子L858R点突变及19外显子缺失突变[1]。但是，在肺癌进展过程中，如何发生EGFR突变，还未可知。目前观察到，EGFR突变主要发生于女性及亚洲人种[2-3]，说明EGFR突变与种系有很大关系。已有研究表明EGFR呈现高度多态性，而且其表达受其多态性调控，特别是EGFR基因第一内含子（CA）n[intron 1（CA）n]与EGFR表达量呈显著负相关[4]，但有关intron 1（CA）n与EGFR突变的关系还未见有系统的分析研究。本研究探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者EGFR基因intron 1（CA）n多态性与EGFR突变情况及患者预后的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 选取2006-06—2012-07在舟山医院进行手术治疗的NSCLC患者未进行放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗的患者351例，采用简单随机抽样方法选取129例。其中男83例，女46例，年龄31～82（59.4±4.1）岁；129例患者经手术切除的肺癌组织（新鲜组织99例，石蜡包埋组织30例）均经切片及HE染色，由2位病理医师诊断为NSCLC，并证实其中含有80%以上肿瘤组织。其中腺癌70例，鳞癌47例，原位腺癌12例；低分化65例，中-高分化64例；淋巴结转移43例，未发生淋巴结转移86例；Ⅰ/Ⅱa期75例，Ⅱb/Ⅲ/Ⅳ期54例。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 取新鲜肿瘤组织30mg，研磨棒研碎，用DNA MINI kit（德国Qiagen公司）提取DNA；石蜡包埋组织制成10μm切片，用DNA FFRPE Tissue kit（德国Qiagen公司）提取DNA，操作均严格按照试剂说明书进行。提取的DNA用1.2%琼脂糖凝胶鉴定，Q-3000微量紫外分光光度计（美国Quawell Technology，Inc公司产品）测定DNA含量。

1.2.2 聚合酶联反应（PCR）扩增和测序 采用PCR方法扩增EGFR基因第一内含子、19外显子及21外显子。EGFR intron1（CA）n上游引物为5′-GGGCTCACAGC AAACTTCTC-3′，下游引物为5′-CAAGGTCTGGGAACCACTGT-3′，产物长度为405 bp；EGFR 19外显子上游引物为5′-CCCCAGCAATATCAGCCTTA-3′，下游引物为5′-TGTG GAGATGAGCAGGGTCT-3′，产物长度为355bp；EGFR 21外显子上游引物为5′-GAATTCGGATGCAGAGCTTC-3′，下游引物为5′-TCATTCACTGTCCCAGCAAG-3′，产物长度为441bp。PCR反应体系：10×Buffer 5μl，5×Q-Solution 10μl，100 mmol dNTP 0.1μl（美国ABI公司），2.5UHot-Star Taq DNA聚合酶（德国Qiagen公司），50 ng模板DNA 5μl，ddH2O补足体积至50μl。PCR反应条件：95℃15min；94℃15s，60℃30s，72℃1min，10个循环；94℃15s，56℃30s，72℃1min，25个循环；72℃10min。取5μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（100V，30min），ChemiDoc凝胶成像仪判定扩增片段。

1.2.3 PCR产物纯化及测序 用EasyPureTMPCR Purification Kit（北京全式金公司）纯化PCR产物，严格按试剂说明书操作。测序反应PCR：1μl BigDye，0.5ml BigDye seqBuffer，1M引物（3.2pmoL/μl），1μl纯化PCR产物，1.5μlddH2O。96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4 min，25个循环，4℃恒温，正反向测序。测序反应PCR产物用乙醇/EDTA沉淀法纯化，Hi-Di Formamide溶解DNA后，95℃变性4 min，迅速置冰中冷却4min，然后在ABI3100XL基因分析仪上样电泳。

1.2.4 测序结果分析 采用ABI Sequencing Analysis V5.4软件分析原始测序结果，ABI SeqScap软件与EGFR序列进行比对分析，结合人工校对，判断EGFR基因突变情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验（1≤T＜5且n≥40采用校正χ2检验，T＜1或n＜40采用Fisher精确概率法），均为双侧检验危险因素采用logistic回归分析，生存率的比较采用kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，预后因素采用Cox分析。

2 结果

2.1 NSCLC患者EGFR基因突变及长短intron1（CA）n多态性与临床病理特征的关系 在129例NSCLC患者中，检出EGFR基因突变35例（27.1%），其中EGFR19外显子21例（16.3%）（图1），21外显子15例（11.6%）（图2），频率最多的EGFR intron 1（CA）n等位基因为（CA）20（50例，38.8%，图3），其次为（CA）16（34例，26.4%，图4）、（CA）19（11例，8.5%）、（CA）18（9例，7.0%）、（CA）21（8例，6.2%）、（CA）15（7例，5.4%）、（CA）17（7例，5.4%）、（CA）22（3例，2.3%）。根据患者EGFR intron 1（CA）n分布的中位数，将（CA）n分为短（CA）n组[（CA）n≤19）[和长（CA）n组[（CA）n＞19）]。NSCLC患者EGFR基因突变及长短intron 1（CA）n多态性与临床 病理特征的关系见表1。

图1 ERFR 19外显子E746-A750del

图2 EGFR 21外显子L858突变

图3 EGFR intron（CA）20重复多态性

图4 EGFR intron（CA）16重复多态性）

由表1可见，NSCLC患者EGFR基因突变与性别、肺癌组织学类型、是否吸烟有关，差异有统计学意义（P＜0.05）。（CA）n等位基因与患者的年龄、性别、吸烟状况、组织学类型、淋巴结转移和临床分期差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多态性与突变的关系 见表2。

表2 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多态性与突变的关系[例（%）]

由表2可见，NSCLC患者短（CA）n与EGFR基因突变有关，特别是19外显子突变，差异有统计学意义（均P＜0.05），但与21外显子突变无明显相关，差异无统计学意义（P＞0.05）。其中（CA）16与患者19外显子突变有关，差异有统计学意义（P＜0.05），而（CA）20的患者较少发生EGFR 19外显子突变，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 NSCLC患者EGFR基因intron1（CA）n多态性与突变Logistic回归分析见表3。

表3 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多态性与突变Logistic回归分析

由表3可见，将变量赋值：长（CA）n=0，短（CA）n= 1；其他=0，（CA）n=1，二元条件Logistic回归分析显示NSCLC患者EGFR基因（CA）16是EGFR突变，特别是19外显子突变的危险因素（均P＜0.05）。

2.4 EGFR基因intron 1（CA）n多态性与NSCLC患者总生存时间的关系 Kaplan-Meier生存曲线结果显示，自肺癌根治术后短（CA）n的NSCLC患者平均生存时间为54.65个月，短（CA）n患者平均生存时间为52.89个月，长（CA）n患者平均生存时间为57.25个月，差异无统计学意义（P＞0.05，图5）。对总生存时间多因素COX回归分析结果（表4）亦显示，EGFR基因intron 1短（CA）n并不是NSCLC患者预后的危险因素（OR= 1.247，95%CI=0.660～2.355，P＞0.05）。

图5 短（CA）n与长（CA）n NSCLC患者总生存时间的比较

表4 NSCLC患者术后总生存时间的Cox危险因素分析

3 讨论

根据外显子突变部位的不同，EGFR突变表现为各种不同的临床模式，如在19外显子上表现为片段缺失，在18及21外显子上则表现在单核苷酸突变。有研究报道EGFR基因21外显子突变主要发生在女性、非吸烟的腺癌患者，而19外显子突变则与男性有关[5]。本结果显示NSCLC患者EGFR突变与女性、非吸烟者及腺癌有关，与之前研究结果相一致[2-3]。EGFR第一内含子（CA）n重复序列多态性在本组中国人群中的分布主要为（CA）20，其次为（CA）16，与研究报道的东亚裔人群（CA）n分布一致[6]。

EGFR基因第一内含子中包含1个由9～23CA的短重复序列，其重复次数可影响基因的转录活性，与EGFR mRNA水平呈负相关，这可能是因为RNA延长终止的位点位于CA重复序列附近，那里有2个主要的独立转录起始位点，当CA重复序列延伸时，EFGR多态性区域可以高度折叠，影响DNA螺旋，并增强阻遏蛋白的结合性，但其具体的确切机制尚不清楚[7]。有多项研究显示NSCLC患者携带短CA重复序列与EGFR基因突变有关，特别是19外显子突变，如Sueoka-Arangeane等[8]发现短CA重复序列与19外显子缺失突变有关，同时携带短CA重复序列且发生19外显子突变的肺腺癌患者EGFR mRNA转录水平要显著高于携带长CA重复序列的患者；Liu等[9]发现NSCLC患者（CA）19重复是EGFR基因19外显子突变的危险因素；Nie等[10-11]发现CA重复次数≤16的NSCLC患者EGFR蛋白表达增加，且携带短CA重复序列的患者经过吉菲替尼治疗后存活明显长于携带长CA重复序列的患者。本结果亦显示短（CA）n与EGFR基因突变有关，特别是19外显子缺失突变，而与21外显子突变则无明显关系。EGFR intron1（CA）16重复的NSCLC患者更易发生19外显子缺失，是致EGFR突变的危险因素。研究发现EGFR 19外显子缺失突变的NSCLC患者EGFR mRNA、蛋白表达水平显著高于未发生突变者[12]，由此推测（CA）n重复序列多态性可能影响EGFR19外显子缺失突变，进而影响其mRNA和蛋白的表达水平，并改变EGFR信号传导通路的活性。但是，NSCLC患者EGFR intron1（CA）n重复序列多态性与总生存时间无明显相关，并不是致肺癌患者死亡的危险因素，与之前研究结果相一致[13]。

可见，在NSCLC进展过程中，EGFR第一内含子短（CA）n，特别是（CA）16重复序列可能是影响19外显子缺失突变的一个重要因素。有关其是否可预测EGFR酪氨酸激酶的疗效还需进一步的研究证实。

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Relationship among epidermal growth factor receptor gene intron 1（CA）n polymorphisms,gene mutations and prognosis in patients with non-small cell lung cancer

Non-small cell lung cancerEpidermal growth factor receptorSingle polymorphism Gene mutation

2012-10-04）

（本文编辑：杨丽）

浙江省科技厅资助项目（2011C37030）

316004舟山医院胸心外科（王烈、乐涵波、张永奎），免疫基因组学联合实验室（何剑营、陈冬冬、续力云、刘晓光、竺王玉）

竺王玉，E-mail：zhuwangyu24@gmail.com