microRNA在心血管疾病中的作用及其法医学意义

（复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032）

microRNA（miRNA或miR）是一类21～25nt大小的单链非编码RNA，通过与mRNA的3′端非编码序列互补结合而导致mRNA降解或抑制蛋白质翻译过程，在转录后水平调节基因表达，调节人类约三分之一的蛋白表达，从而调节生物体的生长发育、细胞增殖与凋亡、疾病的发生与发展等[1]。近年来与心血管疾病相关的miRNA不断被发现，本文拟从心脏组织和循环血液中的miRNA两方面概述与心血管疾病相关的miRNA的研究现状，并探讨miRNA在心源性猝死法医学鉴定中的可能应用。

1 miRNA的生物学特性

miRNA首次由Lee等[2]于1993年在线虫中发现，随后相关于miRNA的研究越来越多，目前发现miRNA既可在细胞内存在，也可在细胞外的循环体液中存在[3-4]。细胞内miRNA通常由pri-miRNA途径合成：非编码序列的基因转录形成pri-miRNA，pri-miRNA在Drosha酶的剪切下变为70 nt左右的茎环状发夹结构即pre-miRNA，此为miRNA的前体，但还不成熟，然后pre-miRNA经核膜上的Exportin5转运入胞浆，在胞浆内由Dicer酶切除茎环的环部结构，形成21～25nt的双链结构，即 miRNA/miRNA*（miRNA* 为miRNA的互补链）。该双链结构中的miRNA再被高亲和地选择，与Dicer酶、Ago蛋白等组装为miRNA诱导的基因沉默复合物（miRISC），miRNA*则被降解[5]。最近胞内miRNA的mirtron合成途径在哺乳动物、果蝇和线虫中被发现[6-8]，证实了miRNA还可由mirtron途径合成，即内含子转录形成的非成熟mRNA部分经剪接子剪接作用（区别于Drosha酶作用）形成了pre-mirtron，而后pre-mirtron经Exportin5转运入胞浆，与pri-miRNA途径类似，由Dicer酶剪切，最终形成miRISC[5]。

目前循环血液中的miRNA被广泛检测及筛选。循环miRNA可能系体细胞在负荷、损伤等刺激下由胞内分泌至胞外。循环miRNA能在循环中逃避RNA的降解从而稳定存在[9]，其机制可能是miRNA通过外体[10]、超微小泡[11]、凋亡小体[12]或者形成蛋白质-RNA复合物[13]来实现。基于此，循环miRNA的主要优点有：（1）稳定，不受环境影响；（2）有组织特异性；（3）易通过RT-PCR定量检测。因此，循环miRNA具有成为心血管疾病生物学标志的巨大潜能，可能为疾病诊断及预后提供参考。

2 miRNA与心血管疾病

未成熟的miRNA没有生物学功能，需要在Dicer酶的作用下完成加工成熟过程。Zhao等[14]利用Chelex技术特异性地敲除胚胎小鼠心肌组织中的Dicer酶基因，结果导致小鼠胚胎出现心包膜水肿、心室心肌层停止发育等多种发育问题，胚胎很快发生心力衰竭而死亡，表明miRNA与心血管疾病有密切关系。

2.1 miRNA与心肌肥大、心力衰竭

心肌肥大、心力衰竭所涉及的miRNA主要有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208 以 及 miRNA-195，而 miRNA-21、miRNA-34a、miRNA-150 等也有报道。其中抑制心肌肥大的有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-150等，促进心肌肥大的有miRNA-208、miRNA-195、miRNA-21、miRNA-34a 等。

Cheng等[15]研究表明，在病理性心肌肥大中miRNA-1、miRNA-133表达下调，提示可能是心肌肥大的普遍通路，并提出了miRNA-1可能的靶基因：Ras-GAP、Cdk9、Rheb 及纤维连接素（fibronectin）。 Carè等[16]研究认为，miRNA-133的靶基因为Rho-A、Cdc42以及Nelf-A/WHSC2。miRNA-1及miRNA-133的下调减少了对靶基因的抑制表达，从而引起心肌肥大。

miRNA-208是由α肌球蛋白重链（α-myosin heavy chain，α-MHC）基因的27位内含子编码产生，能在应激时上调β-MHC的表达，抑制纤维化。Satoh等[17]比较了82例扩张型心肌病和21例正常人的miRNA-208、miRNA-208a以及 miRNA-499后，发现miRNA-208与β-MHC的相关性很好，与扩张型心肌病的关联性大。van Rooij等[18]则不仅证实miRNA-208与心肌肥大相关，还首次提出甲状腺相关的蛋白质激素受体（THRAP1）是miRNA-208的作用靶点。该实验还在大鼠胸主动脉狭窄心肌肥大模型中筛选了一系列表达上调的miRNA，并通过转基因的方法过表达miRNA-195，发现miRNA-195足以引起心肌肥大和心力衰竭。不同的研究得出了不同的结论，提示miRNA与心肌肥大、心力衰竭存在关联性。

2008年，Chen等[19]对中国人血清中所有miRNA进行测序分析，提出血清miRNA是一种能够应用于检测多种癌症和其他疾病的潜在生物学指标。Tijsen等[20]筛选并检测了12位慢性心衰（chronic heart failure，CHF）患者和 12位正常人的血液miRNA，发现miRNA-423-5p在CHF中升高最明显，并且与急性心肌梗死关系密切的miRNA-1、miRNA-208在CHF中并不升高，提示miRNA-423-5p在CHF中特异性较好。此外，Corsten等[21]研究发现miRNA-499在急性心衰（acute heart failure，AHF）患者血液中升高明显，而且肝特异性的miRNA-122也升高，推测为心力衰竭后肝静脉淤血所致。提示miRNA-499与AHF可能有关系。可见AHF、CHF中可能分别和血液中某种miRNA存在密切关联性。

2.2 miRNA与急性冠脉综合征

Bostjancic等[22]研究了24例急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者，发现心脏梗死区的远端心肌miRNA-1高表达，此外Shi等[23]在小鼠模型研究中发现不同的miRNA在心梗后随时间不同表达也各异。如心梗后第2天，miRNA-31、miRNA-223、miRNA-18a以及miRNA-18b表达上调，而第7天miRNA-31、miRNA-214、miRNA-199a-5p 以及 miRNA-199a-3p上调，提示某些miRNA可作为心梗后特定时间的特异性生物学指标，同时也表明不同的miRNA与心梗后心肌后续损伤相关。Fazi等[24]和Sluijter等[25]研究分别发现miRNA-233、miRNA-499与炎症相关，而Shi等[23]研究表明心梗后早期miRNA-233、miRNA-499表达改变，说明心梗后早期以组织炎症损伤为主。

血液循环中的miRNA与急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）的关系一直是研究热点。Ji等[26]发现大鼠血浆miRNA-208可以作为心肌损伤的重要标志，不仅与cTnI线性关系很好，而且在其他部位表达量并不升高，提示miRNA-208具有很好的组织特异性。但Adachi等[27]在临床试验中发现miRNA-208并不具有心肌特异性，而miRNA-499在AMI患者中呈特异性表达。Corsten等[21]在研究32位AMI时发现miRNA-208b和miRNA-499显著升高，和对照组相比分别升高1600倍和100倍。这些均提示miRNA-208a、miRNA-208b或miRNA-499可能作为人类AMI的生物学指标。Wang等[28]发现所有心梗患者在发作4 h内miRNA-208a都能检测到（cTnI不能检测出阳性变化），支持miRNA-208a可作为心梗早期诊断指标的观点，Widera等[29]发现miRNA-133a或miRNA-208b可单独用于ACS的预后诊断。

2.3 miRNA与急性肺动脉栓塞

急性肺动脉栓塞（acute pulmonary embolism，APE）发病急、死亡率高，而目前诊断主要依赖于D-二聚体的检测和胸部CT平扫。D-二聚体检测缺乏特异性，螺旋CT动脉造影特异性虽然能达90%，但检查费用昂贵，且造影剂可能导致过敏、肾衰等副反应，因此寻找一种特异性高又适合推广的生物学指标很有必要。Xiao等[30]选取了32例APE病例、32位正常人以及22位非APE患者的血浆进行筛选，结果发现血浆miRNA-134仅在APE患者血浆中高表达，特异性非常高，因此可能是APE的有效生物学指标。

2.4 miRNA与心律失常

Yang等[31]研究发现正常小鼠注射miRNA-1后出现心律失常，注射miRNA-1阻断剂后心律失常发生率明显降低，提示miRNA-1与心律失常关系密切，进一步研究显示miRNA-1作用的靶基因分别为KCN2和GJA1。其中KCN2为编码细胞膜K+通道蛋白主要亚基，GJA1编码心肌缝隙连接蛋白43（connexin 43，CX43），因此 miRNA-1 通过抑制 K+通道蛋白和CX43的基因表达，从而干扰静息膜电位并阻止心肌细胞间信号传递，最终导致心律失常，这与Bostjancic 等[22]的研究结果一致。此外，Bostjancic 等[22]发现心律失常的样本中miRNA-133表达下调，这与Luo等[32]研究发现的miRNA-133抑制起搏点通道基因HCN2表达结论一致。miRNA-133下调，则HCN2表达上升，因而导致心律失常。由此可见，miRNA-1表达上调，miRNA-133表达下调可能分别导致靶基因的表达异常，从而导致心律失常，这为心律失常的诊断和治疗提供了新的思路。

3 miRNA的法医学意义

miRNA在生物体内广泛存在，大量研究报道了miRNA对心血管疾病的作用，包括心肌肥大、心力衰竭、急性心肌梗死、急性肺动脉栓塞、心律失常等。心肌组织中一种或几种miRNA表达改变可能为某种心血管疾病的特异性指标，因此有望为心源性猝死的死因分析提供新思路。如miRNA-1表达上调被认为是心梗后诱发心肌重构和心律失常的重要因子[31，33]，猝死者检测到miRNA-1表达上调则提示死因为心梗后诱发的心律失常。miRNA主要由细胞内mirtron途径和经典pri-miRNA途径产生，当物理、化学等因素导致细胞受损时，miRNA也会从胞内进入胞外的体循环中。循环血液中的miRNA能通过多种机制逃避循环中RNA酶的降解作用，因此能稳定存在，不受环境影响，从而具有成为疾病诊断及预后的生物学指标的潜能。

与人类心血管疾病相关的miRNA较多，有些miRNA与多种疾病相关，如miRNA-1既与心肌肥大[15]有关，也与心律失常[22，31]、心肌梗死[22]相关；一种疾病可能涉及多种miRNA，如急性冠脉综合征病发后有17种miRNA表达改变[23]，这些miRNA可能通过不同的靶基因而单独影响蛋白表达，也可能在蛋白合成的同一条途径不同环节进行协同调节。相信随着越来越多关于miRNA如何影响心血管疾病的深入研究，人类一定能找到某些心血管疾病特异性的miRNA，作为这些疾病诊疗及预后的新指标，并为心源性猝死死亡机制分析提供新思路。

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