慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展

李妍 杜红延 李红卫

慢病毒载体作为一类来源于逆转录病毒的载体，以其转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞，可容纳较大的基因片段等优点，在科研领域有着良好的发展前景。RNA干扰现象从发现到现在还不足二十年的时间里，发展迅速，被广泛地应用于一些疾病治疗的研究。越来越多的研究都将慢病毒载体运用于RNA干扰技术中，成为在基因功能研究和基因治疗方面的一种有力的手段。本文主要就近年来慢病毒载体在RNA干扰技术中的应用作一综述，讨论其安全性、研究进展和发展前景。

1 慢病毒载体

1.1 慢病毒的基因结构

慢病毒（lentivirus）属于逆转录病毒科，是一种RNA病毒。慢病毒载体（lentiviral vector， LV）是通过去除慢病毒基因组中部分基因，并插入所需的目的基因和标记物构建而成，来源于多个物种，其中以人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）为代表。HIV-1共有9个基因，两端为长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）。含有gag、pol、env 等 3 个结构基因和tat、nef、vif、rev、vpr、vpu 等 6个调节基因。其中，gag编码内膜蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白；pol编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶；env编码gp41和gp120两种糖蛋白。6个调节基因控制着病毒基因表达，在致病上具有重要作用：tat编码的蛋白是HIV复制所必需的反式激活转录因子；rev编码的蛋白也是HIV复制所必需的，缺乏时病毒能转录但是病毒晚期基因不能表达，无法产生子代病毒体；nef、vpr、vpu和vif编码的产物不是必需的，但在体内会影响病毒毒力。

1.2 慢病毒载体的构建

以HIV-1来源为代表的慢病毒载体由载体成分和包装成分组成。载体成分含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件, 同时具有异源启动子控制下的多克隆位点，以及在此位点插入的外源目的基因。包装成分则含有编码产生病毒颗粒所必需的蛋白的结构基因。第三代慢病毒载体应用最广泛，它包含了4种质粒，一个是载体成分，另外三个是包装成分，分别含有基因gag-pol、env和rev。包膜蛋白大多来自水泡性口炎病毒包膜蛋白（vesicular stomatitis virus G-protein，VSV-G），用VSV-G代替HIV-1的包膜蛋白使病毒感染细胞能力增强，扩大了宿主细胞范围。四质粒共转染293T细胞，可获得高滴度、高感染力而不能复制的安全性较高的慢病毒载体[1]。

为提高慢病毒载体的生物安全性，还需对其进行优化。自身失活慢病毒载体的构建是将载体3'端LTR中的U3区增强子和启动子序列去除,导致病毒RNA不能转录[2]，因此该系统的安全性更高。Zufferey等[3]将 HIV 的env、vif、vpr、vpu和nef 基因去除后，载体能够转染静止期细胞和单核细胞来源的巨噬细胞，而且能够在体内有效地转导神经元。这种优化的载体在保留感染非分裂期细胞特性的同时提高了其生物安全性。

1.3 慢病毒载体的优势

慢病毒载体与逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体等相比，具有以下的优点[1]：（1）转染效率高，可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞，例如神经系统、肝脏、造血系统等的非分裂期细胞，免疫反应小；（2）可转移基因片段较大，可插入10 kb左右的基因片段；（3）慢病毒基因组被分成四质粒系统，显著降低了产生有复制能力的病毒（replication competent virus，RCV）的可能性；（4）目的基因与宿主基因组整合，实现目的基因的较长时间表达。

1.4 慢病毒载体的安全性

慢病毒载体的发展迅速，应用广泛，但对于某些特定运用慢病毒载体进行转导仍需要对某些因素进行改良，以提高基因转导的效率。此外，逆转录病毒和慢病毒载体的安全性一直受到关注。

曾有临床研究发现，在接受以逆转录病毒为载体的基因治疗的X连锁重症联合免疫缺陷综合征的患者中，出现白血病的病例[4]。还有报道2例接受基因治疗的X连锁慢性肉芽肿病患者骨髓异常增生[5]。通过研究发现，逆转录病毒载体整合到原癌基因的启动子附近，由于逆转录病毒载体的LTR作为强有力的增强因子，激活了附近的原癌基因使其异常表达。与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的安全性有所提高。Montini等[6]使用Cdkn2a–/–鼠移植模型研究发现，逆转录病毒载体会引起细胞癌变加速，然而对于慢病毒载体，即使插入较大的基因序列或者在细胞中大量表达，都不会影响肿瘤的发生。这很可能是因为自身失活慢病毒载体缺失病毒LTR中的增强子和启动子；另一方面，可能由于慢病毒载体与其他逆转录病毒载体插入整合位点的不同所致。这些研究的结果表明慢病毒载体，尤其是自身失活慢病毒载体较其他逆转录病毒载体的安全性更高。从转导高效性以及疾病治疗的有效性看，慢病毒载体都显示其良好的发展前景。

2 慢病毒载体在RNA干扰技术中的应用

2.1 RNA干扰技术

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）其机制是通过抑制特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。将与内源性mRNA编码区同源的双链RNA导入细胞中，双链RNA先降解为siRNA，随后siRNA与一些蛋白合成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），引发靶mRNA降解而导致基因表达沉默。RNAi作用机制具有普遍性、特异性、高效性、位置效应等特点。在沉默基因的表达方面，因为任何导致或者促进疾病发生的蛋白质都容易受RNAi影响，所以RNAi比传统的药物更具有特异性和灵活性，已被广泛应用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。将慢病毒载体作为RNAi技术的载体，可以结合两者优势，特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达，成为基因功能研究和基因治疗的有力手段[7]。

2.2 在病毒感染疾病方面

对病毒引起的疾病治疗，应从阻断病毒感染途径、抑制病毒复制和蛋白表达的方面着手。利用慢病毒载体能感染分裂期和非分裂期细胞、转染效率高等特点，结合RNAi技术，可抑制和阻断人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒等在人体内的感染。

对于AIDS的治疗方法，目前有一种高效抗逆转录病毒疗法（highly active antiretroviral therapy，HAART），通过多种抗病毒药物联合使用来缓解病情，但是并不能彻底治愈，还可能导致长期的毒性作用并可能产生耐药性病毒变异体。Centlivre等[8]建立RNAi的慢病毒载体，导入到人类造血干细胞中，在“人类免疫系统”（human immune system）BALB/c Rag2-/-IL-2Rγc-/-小鼠模型中表达抗病毒的shRNA，能提高体内免疫系统中细胞的多向分化能力，并形成不受HIV-1复制影响的CD4+T细胞。由于单独使用一种抗HIV-1的shRNA会引起靶基因序列出现变异而产生RNAi逃避变异体，而且HIV-1可以改变其靶mRNA的结构。为此，可以构建含有多个病毒序列的组合性RNAi攻击病毒，例如多重shRNA，miRNA样的多顺反子以及e-shRNA。首先在体外构建含有抗HIV-1的shRNA或miRNA的慢病毒载体，导入CD34+造血干细胞，随后将细胞导入病人体内。这些CD34+细胞能使抗HIV-1的髓样和淋巴样细胞群增多，以增强细胞抵抗HIV-1的能力[9]。

乙型肝炎在我国广泛流行，严重影响患者肝功能，而且容易导致肝硬化、肝癌，为此研究有效预防和治疗乙肝的方法是关键。罗祥基等[10]通过构建HBs基因RNAi慢病毒载体感染肝癌细胞。根据实验结果可以发现HBV DNA和HBsAg表达显著下降，说明构建HBs基因RNAi慢病毒载体抑制HBV的复制和抗原表达的作用显著，为乙型肝炎的治疗提供了一个新的平台。

2.3 在癌症方面

癌症的发生主要与基因突变有关，尤其是与癌基因的激活有关，有突变、基因扩增和染色体重排3种激活机制。目前主要通过手术、放疗和化疗等手段进行治疗。基因治疗作为一种新的方法正处于快速发展阶段，其中RNAi技术已经成为一种全新的癌症治疗方法，再加上慢病毒载体能够感染分裂期和非分裂期细胞等特性，在鼻咽癌、宫颈癌、白血病、肝癌等多种癌症研究中起着重要的作用。

Nagaraja等[11]使用慢病毒载体介导的RNAi技术，特异性地使Hsp-25或Hsp-27基因表达沉默，能够促进PA28α蛋白的合成，增强蛋白酶体的活性，从而提高抗原提呈能力，消除肿瘤转移的潜能，增强CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力和记忆能力。除了通过提高机体自身对肿瘤细胞的杀伤能力，许多实验还通过构建致癌基因的RNAi慢病毒载体，抑制肿瘤生长或诱导肿瘤细胞凋亡。例如敲除MYCN可以明显有效地抑制人成神经细胞瘤生长[12]；干扰Caveolin-1 mRNA并抑制Caveolin-1蛋白表达，能有效地抑制体外和小鼠体内下咽鳞状细胞癌的生长[13]；慢病毒载体介导的RNAi，显著抑制CXCR4在体内和体外口腔鳞状细胞癌细胞中的表达，CXCR4的减少促进细胞周期的停滞、肿瘤细胞的凋亡和阻止肿瘤的生长，同时改变了许多相关基因的表达，提示CXCR4可成为肿瘤基因治疗的一个新靶点[14]。

另外一个方面，在肿瘤的治疗过程中，对化疗药物和放射性疗法的耐受性也是一个不容忽视的问题。目前发现慢病毒载体介导的RNAi技术对该问题的解决具有一定的潜力。化疗是目前治疗肿瘤的主要方法之一，由于治疗过程中肿瘤细胞会产生多重耐药性（multiple-drug resistance，MDR），给疾病的治疗带来了困难。引起多重耐药性的原因很多，其中MDR1基因编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）起着主要作用。P-gp具有能量依赖性“药泵”功能，P-gp既能与药物结合，又能与ATP结合，ATP供能，使细胞内药物泵出细胞外，减低了细胞内的药物浓度，从而使肿瘤细胞产生耐药性。可以通过构建RNAi慢病毒载体，显著降低MDR1基因和P-gp在多重耐药性白血病细胞系中的表达，结果恢复了肿瘤细胞对化学药物的敏感性[15]。肿瘤耐药性低，对药物敏感，提高了非霍奇金淋巴瘤、白血病等肿瘤化疗的疗效。胰岛素样生长因子受体1（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）的过度表达与恶性肿瘤细胞的生长以及对放疗和化疗的抵抗性有关。Wang等[16]通过慢病毒介导的shRNA靶向IGF-1R并结合化疗，能够有效抑制体内和体外的骨肉瘤细胞的生长，同时还增强了Caspase-3介导肿瘤细胞凋亡的作用。可见，慢病毒载体介导的RNAi技术成为抗癌治疗的一种具有潜力的手段。

2.4 在心血管疾病方面

目前许多心血管疾病的病因仍不是非常清楚，通过RNAi慢病毒载体，在研究相关疾病的病因与发病机制方面起着越来越重要的作用。

心肌细胞凋亡可以清除衰老损伤细胞，也可引起机体稳态失调，导致心血管疾病的发生。近年来,人们运用RNAi技术，从影响心肌细胞凋亡的各种因子及其作用着手,研究心血管疾病的发病机制，从而探索更好的治疗方法。刘彬等[17]构建靶向抑制大鼠凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1）RNAi慢病毒载体，从实验中可以发现抑制LOX-1能减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡。说明LOX-1可能在H2O2诱导的心肌细胞损伤中发挥着重要作用。

脑组织缺血缺氧时会导致细胞自噬[18]，而Beclin-1的作用是促进自噬。将靶向编码Beclin-1基因的RNAi慢病毒载体，导入大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的大鼠模型，抑制Beclin-1的表达，能使神经前体细胞、成熟与未成熟神经元数量增加，并且减少缺血区域中央的神经元凋亡以及梗死的体积。通过该种方法抑制Beclin-1的表达可以减少脑缺血时引起的组织损伤，改善脑缺血的症状[19]。

2.5 在神经系统疾病方面

利用慢病毒载体感染非分裂期细胞的特性，慢病毒载体介导的RNAi在神经系统疾病的研究中显示出重大意义。Mazarakis等[20]用狂犬病毒包膜蛋白代替HIV-1的包膜蛋白，构建狂犬病毒包膜蛋白假构型慢病毒载体，利用狂犬病病毒嗜神经性和逆向轴突运输的特性，经外周或在中枢神经系统注射，都可发现目的基因在中枢神经系统的表达，这就增强了慢病毒载体介导的基因治疗在神经系统疾病方面的效用。肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种致命的神经退行性疾病，会导致中枢神经系统的运动神经元死亡，主要是编码SOD1的基因发生突变所致。运用慢病毒载体介导的RNAi使小鼠体内过度表达SOD1的特定基因沉默，使其表达显著下降，实验发现脑干和脊髓易感运动神经元的寿命延长。此外，SOD1基因沉默还增强了实验动物运动神经元的功能，明显延缓了ALS的发病，延长了一般的寿命[21]。

重复多次服用镇痛药、精神兴奋药、抗精神病药等易成瘾药物会因其与中脑边缘多巴胺系统相互作用[22]，使机体产生欣快感，造成药物成瘾性。Bahi等[23]通过改变大鼠多巴胺D3受体（D3R）的表达可以改变可卡因的兴奋作用，运用RNAi慢病毒载体抑制其表达可增强兴奋作用，然而使其过度表达则会使兴奋作用降低，提示 D3R可作为服用可卡因造成的药物成瘾性基因治疗的一个重要靶点。另外，神经兴奋药会引起中脑边缘多巴胺系统的尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）大量表达，以慢病毒作为载体增强或者抑制uPA的表达，可以观察到可卡因诱导的行为改变，通过siRNAs抑制uPA的表达能够抑制这种行为改变[24]。由此看出在药物成瘾性的治疗方面慢病毒载体介导的RNAi技术将发挥重要的作用。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）患者大脑皮质和海马区域出现老年斑，其中心部分主要是由β-淀粉肽前体蛋白降解而来的β-淀粉肽，产生这种毒性淀粉肽需要β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶。Sierant等[25]建立慢病毒载体介导的RNAi以沉默大鼠脑中神经干细胞编码BACE1的基因，有效降低脑中β-淀粉肽的积聚，为预防和治疗阿尔茨海默病提供了一种新的方法。

除此之外，该治疗技术在亨廷顿舞蹈病（Huntington's disease）、帕金森病（Parkinson's disease）等严重神经系统疾病的研究中也都取得了一定的成果。

3 总结与展望

近几年来，RNAi技术被广泛地应用于各种领域，包括基因功能的研究以及疾病的发病机制和治疗方法的研究。但技术的实施过程中仍存在一些困难需要克服。脱靶效应（off-target effect）一直是研究的重点，也是需要克服的困难之一。虽然现在仍不能找到普遍通用的方法避免所有的脱靶效应，但通过2'-OMe的修饰[26]或者DNA的替换[27]可以显著地降低脱靶效应。相信通过对RNA结构的合理修饰和改进，这些问题终将被克服。

发展慢病毒载体介导的RNAi技术，发现与疾病相关的影响因素，并尝试由此着手研究治疗的方法，达到治疗疾病的效果。为此还应该保证更高的安全性、有效性和可靠性，并逐步从体外实验和动物实验进入到临床试验阶段，相信该技术将在今后的研究领域和临床实际应用方面有着更广阔的前景。

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