SAH后下丘脑中5-羟色胺、去甲肾上腺素水平改变及地塞米松的作用

刘艳 熊丹 张小洁 钱聪 信照亮

●论 著

SAH后下丘脑中5-羟色胺、去甲肾上腺素水平改变及地塞米松的作用

刘艳 熊丹 张小洁 钱聪 信照亮

目的 观察大鼠实验性蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后下丘脑组织匀浆5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素（Noradrenaline，NA）水平随时间变化情况，以及地塞米松（dexamethasone，DXM）不同给药途径对两者水平的影响。 方法 实验大鼠随机分为空白对照组、SAH组、腹腔给药组和脑池内给药组，按时间分为3、7、14、21d 4个亚组，采用高效液相色谱法（HPLC）测定下丘脑组织中5-HT和NA的含量。 结果 5-HT水平在SAH后3d开始上升，7d达到高峰，14d仍维持在较高水平，21d下降到接近3d时的水平；NA的水平从第3天开始上升，第7、14、21天，水平呈逐渐升高的改变，与5-HT变化的时间模式不一致。DXM治疗组中5-HT水平均较SAH组明显降低（均P＜0.05），且两种用药途径间无明显差异（P＞0.05）；DXM治疗对NA水平影响不大（P＞0.05）。 结论 SAH发生后，可导致下丘脑组织中5-HT和NA水平升高，可能与SAH后睡眠/觉醒异常的发生相关，但两者变化的时间模式不同。DXM可降低SAH后下丘脑组织中5-HT水平，可能是其促进清醒的机制之一。DXM脑池内给药是一种可选择的用药途径。

蛛网膜下腔出血 5-羟色胺 去甲肾上腺素 地塞米松

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是神经内、外科的常见疾病。对SAH后蛛网膜下腔内发生的炎症以及迟发性脑缺血的机制研究很多[1]，而对SAH后的脑组织改变和对脑功能的影响，研究较少[2]。单胺类递质在睡眠/觉醒中具有重要作用[3]。SAH发生后，是否会引起脑组织中单胺递质水平的变化，从而导致睡眠/觉醒的异常变化，研究报道不多，且观察的时间多限于48h内[4]。有研究发现，地塞米松（DXM）蛛网膜下腔（脑池内）应用，能够减轻脑血管痉挛[5]，是否具有促清醒作用及其机制，未见报道。本实验将探讨SAH后下丘脑组织中5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素（Noradrenaline，NA）水平变化模式以及DXM不同用药途径对两者水平的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 52只健康清洁级雄性SD大鼠，体重250g左右，浙江大学实验动物中心提供。采用数字表分组法随机分为：空白对照组（4只）、SAH组（制模后3、7、14、21d各4只）、脑池内给药组（制模后3、7、14、21d各4只）、腹腔给药组（制模后3、7、14、21d各4只）。在上述预定的时间进行各项检测。各组中动物如有死亡则予以补充。

1.2 动物模型的建立 SAH组：采用10%水合氯醛0.35ml/100g腹腔内注射麻醉后，大鼠仰卧位固定于实验台上，常规消毒铺巾后，分离一侧股动脉，插入套管针留置备用。之后翻转大鼠，俯卧头低位固定，正中切开暴露寰枕筋膜，用特殊制备的穿刺针进行穿刺，成功后先回抽脑脊液0.2ml，然后取股动脉血0.2ml缓慢经穿刺针注入枕大池。拔针后以医用EC胶封闭硬脑膜穿刺孔，并保持头低位0.5h。缝合切口，待麻醉复苏后送回笼中喂养。48h后再次打开寰枕筋膜，枕大池穿刺，注动脉血0.2ml，拔针后再次以医用EC胶封闭硬脑膜穿刺孔，保持头低位0.5h，缝合切口，完成两次注血SAH模型的制作。

腹腔给药组：SAH模型制作结束，15min后腹腔给予DXM 1 mg/100g大鼠体重。

脑池内给药组：SAH模型二次注血后，先不拔出穿刺针，15min后注入DXM 0.1mg/100g大鼠体重，给药完成后再封闭穿刺点。

空白对照组：0.2ml 0.9%氯化钠溶液代替0.2ml动脉血，步骤同SAH组。

1.3 标本采集及检测 分别于模型二次注血后3、7、14、21d，大鼠麻醉后，磷酸盐缓冲液左心室灌注，并剪开右心耳，待流出液变白后，断头，快速取出下丘脑。将取出的脑组织放入含有100μM Na2-EDTA和100ng/ml异丙醇/高氯酸的匀浆器中，冰上匀浆20s；匀浆15 000 g离心30min；上清液用1M乙酸钠溶液调整pH值在3左右；将上清液使用0.45μm的滤膜过滤，用馏分收集器收集过滤液，用高效液相色谱（HPLC）检测NA和5-HT的水平。HPLC使用反向色谱柱（ODS-80 4.6mm i.d. ×15cm）和电化学检测仪（Model ECD-100,Eikom Co.,日本），用含有5mg/L Na2-EDTA,15%甲醇，200mg/L辛烷磺酸钠的乙酸钠-柠檬酸缓冲液洗脱色谱柱[6]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料用表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 SAH后下丘脑组织匀浆各组不同时间点5-HT水平的改变 见表1。

表1 SAH后下丘脑组织匀浆各组不同时间点5-HT水平（ng/g脑组织）

由表1可见，SAH组在3、7、14、21d下丘脑5-HT水平均较空白对照组明显升高（均P＜0.01）；腹腔给药组在3、7、14、21d下丘脑5-HT水平均较SAH组明显降低（均P＜0.01）；脑池内给药组应用DXM组3d下丘脑5-HT水平较SAH组明显降低（P＜0.01），7d下丘脑5-HT水平较SAH组降低（P＜0.05）。

2.2 SAH后下丘脑组织匀浆各组不同时间点NA水平的改变 见表2。

表2 SAH后下丘脑组织匀浆各组不同时间点NA水平（ng/g脑组织）

由表2可见，SAH组在7、14、21d下丘脑NA水平均较空白对照组升高（均P＜0.05）；腹腔给药组、脑池内给药组下丘脑NA水平与SAH组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

睡眠/觉醒的调节系统包括众多的神经核团和递质,彼此间形成相互制约的神经网络,同时也与内稳态和生物节律的影响有关[7]。一般认为，视前区-下丘脑前部与睡眠相关，下丘脑后部与觉醒相关，且睡眠中枢与唤醒中枢处于交互抑制状态[8]。有研究发现，下丘脑结节乳头状核和腹外侧视前区是两个重要的与睡眠/觉醒相关的区域。因此本研究选择下丘脑作为观察的部位。5-HT是一种抑制性神经递质，除与抑郁症、焦虑症、强迫症、认知和疼痛等密切相关外，5-HT可通过激动不同的受体亚型发挥与睡眠/觉醒调节相关的作用，激动突触前5-HT1A受体可延长非快速眼动睡眠（NREMS）并减少觉醒；激动突触后5-HT1A受体可抑制快速眼球运动睡眠（REMS）和促进觉醒；拮抗5-HT2受体可促进NREMS，抑制REMS，促进觉醒[9-13]。NA也是一种神经递质，在NREMS期缓慢释放，在REMS期则完全静止。可见，5-HT与NA是中枢神经系统内重要的单胺类神经递质，在维持睡眠/觉醒中可能相互协同发挥作用。

文献报道，脑卒中发生后，单胺类递质在各脑区有着不同的变化情况，选择的部位和时间不同结果也各不尽相同。刘国军等[4]用高效液相色谱仪，观察对比正常鼠与大脑中动脉栓塞24h后大鼠脑干各区的NA、多巴胺与5-HT含量的变化，在栓塞24h时5-HT明显高于正常组，并据此认为，多递质的动态失衡与卒中后睡眠/觉醒障碍的发生有关。

SAH后最常见严重的并发症是迟发性脑缺血，一般在3d出现，7d最为严重，14d后开始下降，21d后恢复。有学者用荧光分光光度法检测了大鼠SAH后48h脑皮质中NA、5-HT和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的水平，发现SAH引起脑皮质NA、5-HT和5-HIAA的明显升高。分脑区研究发现，SAH后NA的升高仅见于脑皮质，脑干、小脑等，其他脑区则无明显变化（未测定下丘脑区）。5-HT与NA均不易通过血脑屏障，这提示SAH后脑皮质内5-HT和NA水平的升高主要与脑内的合成增加有关。本研究发现，下丘脑5-HT水平在SAH后3d开始上升，7d达到高峰，14d仍维持在较高水平，21d下降到接近3d时的水平，与SAH后的最主要的并发症迟发性脑缺血的发生时间模式一致（但两者之间的关联机制有待证实）。而下丘脑NA的水平，从第3天开始上升，第7、14、21天水平呈逐渐升高的改变，与5-HT水平变化的时间模式不一致。5-HT和NA之间的变化关系有待进一步研究。

糖皮质激素受体（GR）广泛分布于脑组织。一般认为，糖皮质激素（GC）主要是通过与GR结合后，上调抗炎基因和（或）下调抑炎症基因的转录实现其抗炎作用。DXM是临床上最常用的GC之一，通过稳定溶酶体膜，诱导T细胞凋亡，抑制细胞因子产生、巨噬细胞移行和致炎物质缓激肽和前列腺素的释放等发挥作用，还能抑制5-HT产生的作用。GC通过经典受体介导的基因转录调节作用需要一定时间，包括GC透过细胞膜到诱导或抑制相关蛋白的转录，至少需要30min，蛋白水平变化再引起有治疗意义的变化，需要数小时到数天时间；GC也可以通过调节胞质内钙离子信号在几分钟内就发挥快速的作用，而发挥这种非受体依赖机制需要的剂量，必须超过与体内储备GR结合所需的激素量，这是大剂量冲击治疗的可能机制。不良反应多发生在大剂量应用时，因此探讨不同给药途径的效果以减轻不良反应是一种选择。

有实验证明，DXM脑池内注射对保护脑血管内皮细胞和平滑肌细胞作用显著，并减轻脑水肿，预防蛛网膜粘连和脑积水发生[14]。本实验发现，脑池内小剂量注射与腹腔大剂量全身应用，均能降低下丘脑5-HT水平，这可能与DXM的促清醒作用相关，因两种用药途径的作用差异不甚明显，脑池内小剂量应用可能是一种较好选择。DXM影响5-HT水平的机制，除可能通过作用于GR抑制5-HT的产生有关外，也可能通过抑制SAH后蛛网膜下腔内的炎症和免疫反应，改善迟发性脑缺血有关。

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（本文编辑：田云鹏）

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（收稿日期：2012-06-18）

（本文编辑：沈昱平）

Levels of 5-hydroxytryptamine and noradrenaline in rat hypothalamus after subarachnoid hemorrhage and effects of dexamethasone

Objective To investigate the levels of 5-hydroxytryptamine(5-HT)and norepinephrine(NA)in rat hypothalamus after subarachnoid hemorrhage(SAH),and the effect of dexamethasone(DXM)on 5-HT and NA.Methods The rats were randomly divided into 4 groups:the blank,SAH control,SAH treated by intracisternal DXM and SAH treated with intraperitoneal DXM.The levels of 5-HT and NA were measured by high performance liquid chromatograph.Results The 5-HT in hypothalamus tissue began to rise in 3d,reached to peak in 7d,remained at high level in 14d and went down to d3 level in 21d,which was consistent with the timing of delayed cerebral ischemic.The NA in hypothalamus tissue began to rise in 3d and kept rising in 7, 14 and 21d,which was not consistent with the mode of 5-HT.The levels of 5-HT were decreased after DXM treatment and there was no significant difference between intracisternal and intraperitoneal administration.There were no changes of NA levels after DXM treatment.Conclusion 5-HT and NA levels in hypothalamus are increased after SAH,which may be involved in abnormality of sleep/wakefulness,but the time modes of 5-HT and NA are different.DXM may promote wakefulness by lowering 5-HT level in hypothalamus after SAH,and DXM can be administrated intracisternally as an alternative way.

Suharachnold hemorrhage 5-hydroxytryptamine Noradrenaline Dexamethasone

2012-11-22）

国家自然科学基金项目（30370497）；浙江省社会发展项目（2007C33039）

325035 温州医学院（刘艳、熊丹、张小洁）；浙江大学医学院附属邵逸夫医院神经外科（钱聪）；温州医学院、浙江医学高等专科学校（信照亮）

信照亮，E-mail:wxk555@sohu.com