炮制方法对珍珠母总蛋白质含量及凝胶电泳特征谱带的影响

李 影,孙佳明,杜 鹤,刘文丛,张 辉＊

(1.长春中医药大学,长春 130117;2.吉林农业大学,长春 130118)

珍珠母Margaritifera concha为我国常用中药材,具有平肝潜阳,安神定惊,明目退翳的功效。据《中国药典》2010年版记载,珍珠母为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)、褶纹冠蚌 Cristaria plicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝 Pteria martensii(Dunker)的贝壳。[1]具有平肝、潜阳、定惊、止血的功效,用于治疗头眩、耳鸣、心悸失眠等症,主要的成分为碳酸钙,含量在90%以上,有机质含3.5%左右,另含少量的镁、铁离子、氨基酸。

肽键热振荡理论认为动物药材中的蛋白质、肽类有效成分经热炮制后,通过分子中肽键热振荡作用,导致其结构发生不同程度的改变,进而生理活性发生相应的变化。而超微粉碎技术可在低温状态下进行,并且粉碎速度快,粉碎粒径达到纳米级,有利于保留不耐高温的生物活性成分及各种营养成分,从而提高药效。为了分析不同炮制方法对珍珠母蛋白质含量及其凝胶电泳特征谱带的影响,针对珍珠母生品、烘烤品和超微粉样品,采用考马斯亮蓝法及凝胶电泳技术,试图从珍珠母不同炮制方法样品蛋白质组成及含量变化的规律中,为后续珍珠母炮制工艺研究提供实验数据及理论依据。

1 实验材料

1.1 动物来源 珍珠母Margaritifera concha采集于吉林省大安市嫩江畔月亮湖,经长春中医药大学研发中心张辉教授鉴定为淡水双壳类蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)的贝壳。

1.2 提取分离 珍珠母生品即将干燥的珍珠母粉碎后过60目筛。珍珠母炮制品(烘烤品)即将粉碎后过60目筛的珍珠母生150℃烘箱中烘烤1 h,取出晾干,即可[2]。珍珠母超微粉即将干燥的珍珠母超微粉碎得粉末。3 Kg珍珠粉(生品、超微粉、烘烤品)加入15 000 mL 2mM Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.0),4 Co搅拌72 h,4 Co 12 000 r/min离心30min,双层滤纸抽滤得上清液,0.45 μ m微孔滤膜滤过,超滤分段浓缩≤1 KDa段、≤10 KDa段、>10 KDa段,每段滤液分别合并,冻干[3]。

2 试剂与仪器设备

2.1 试剂 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.0)、醋酸、甲醇 、乙酸 、乙醇 、牛血清白蛋白 、Tris、TEMED 、SDS 、甘氨酸、丙稀酰胺(SIGMA公司)、考马斯亮蓝G-250、溴酚兰指示剂、2-巯基乙醇、过硫酸铵等。

2.2 仪器设备 电子天平(MAX=210 g,d=0.001 g)(SARTORIUS AG),pH计(上海虹益仪器仪表有限公司),D5-10型低速离心机(上海安亭科学仪器厂),ZFQ-85A型真空浓缩装置(上海医械专机厂),DYCZ-24D型双垂直电泳槽(北京六一仪器厂),ECP3000型三恒电泳仪(北京六一仪器厂),凝胶成像仪及分析系统Lab Works4.6(Bionimaging Life Science Research)等。

3 方法

3.1 对照样品溶液制备 取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于 50 mL 95%乙醇,加入 100 mL 85%H3PO4,用蒸馏水稀释至1 L,滤纸过滤[4]。

3.2 标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白(BSA),预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用去离子水配制成1.0 mg/mL蛋白溶液10 mL。

3.3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL,分别置具塞试管中,各加去离子水至0.1 mL,再分别加入酸性染色液5.0 mL,立即混匀,在595 nm的波长处测定吸光度,同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度,得测定总蛋白含量的标准曲线回归方程为Y=33.373X-0.024 4(R=0.999 2)。

3.4 蛋白质含量的测定 分别量取珍珠母生品、烘烤品、超微粉蛋白质液0.1 mL,加去离子水4.9 mL,混匀,加考马斯亮蓝溶液于595 nm波长处测吸光度,代入标准曲线的线性回归方程求出含量。

3.5 SDS-PAGE测定珍珠母蛋白的分子质量 配制10%分离胶和5%浓缩胶,等胶凝时处理珍珠母蛋白样品,取适量样品放EP管中,加入SDS(未加DTT)后加巯基乙醇(15～20 μ L)混匀,100 ℃水浴加热 3～5 min。将处理好的珍珠母样品15 μ L加入到凝胶孔中,连接电泳仪,打开电源,调整电压70 V开始电泳,大约25 min后溴酚兰指示开始进入浓缩胶后,将电压调至120 V,待指示剂溴酚兰到达胶的底部距离下缘0.5 cm时停止电泳,把凝胶取出,脱色直至出现清晰的电泳带为止。[5]

4 结果

4.1 蛋白质浓度测定 按“1.2”项下制备样品,分别取珍珠母生品、烘烤品超微粉,按“3.4”项下计算得珍珠母生品总蛋白含量为29 ng/g,烘烤品总蛋白含量为23.15 ng/g,超微粉总蛋白含量为33.28 ng/g。由此可以得出珍珠母生品,烘烤品,超微粉总蛋白含量依次升高,超微粉总蛋白含量最高。

4.2 珍珠母蛋白质分子质量测定结果 SDS-PAGE凝胶电泳检测结果,根据标准蛋白的迁移距离计算出相对迁移率,得到珍珠母蛋白分子量的大小。

珍珠母生品总蛋白的4个条带的相对分子质量分别是50.8、41.923、38.693、23.317 KDa;烘烤品总蛋白的4个条带的相对分子质量分别是 51.017、41.923、38.693、23.124 KDa;超微粉总蛋白的 4 个条带的相对分子质量分别是 51.017、41.744、38.373、23.511 KDa。

5 讨论

本实验将炮制方法不同的珍珠母总蛋白利用闪蒸浓缩并冻干,冻干粉通过考马斯亮蓝法比较,发现珍珠母超微粉总蛋白含量最大,而烘烤品、生品的依次降低。进而应用SDS-PAGE凝胶电泳对3种总蛋白进行分析,结果它们条带数目基本一致,说明蛋白质相对分子质量分布基本相同,经计算珍珠母总蛋白中4个条带的相对分子质量分别约为 23.3、38.6、41.9、51.0 KDa;生品、烘烤品和超微粉各条带平行比较时颜色依次加深,说明其蛋白含量依次升高,这与前面考马斯亮蓝法测定含量结果相附。尤其明显的是生品在相对分子质量23.3 kDa条带颜色极浅,烘烤品和超微粉颜色明显加深,依据肽键热振荡理论,说明珍珠母烘烤品在炮制加热过程中,组织疏松,有效成分易于溶出,且某些大蛋白肽键断裂使相对分子质量23.3 kDa的蛋白含量增加;而超微粉粉碎度增加,发生了物理变化,使蛋白质溶出率极大提高。以上结果提示现代超微粉碎技术完全可以作为新的炮制方法来取代贝壳类药材的传统热炮制工艺,这为中药现代炮制理论进行了有益的补充。

[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2010.

[2]梁卫,劳家和.中药马氏珍珠母炮制方法初探[J].中药材,1988,11(3):34-35.

[3]张芩.合浦珠母贝贝壳形成相关蛋白及基因的研究[D].北京:清华大学,2006.

[4]王孝平,邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3):40-42.

[5]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2000:90-103.