在骨缺损修复中生物材料引起的免疫反应对骨微环境影响的研究进展

孙宏晨，朱 阳，姜力铭，李道伟，王丹丹，唐宇欣

(吉林大学口腔医院病理科，吉林 长春 130021)

在骨缺损修复中生物材料引起的免疫反应对骨微环境影响的研究进展

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孙宏晨，朱 阳，姜力铭，李道伟，王丹丹，唐宇欣

(吉林大学口腔医院病理科，吉林 长春 130021)

局部应用生物材料促进骨组织再生是骨缺损修复的重要手段。目前研究认为：生物材料植入骨缺损后可以引起机体的固有免疫反应和适应性免疫反应，这些反应既可以阻碍生物材料更好地发挥成骨作用，也可以通过直接调节成骨和破骨细胞的活化及分化最终调节骨形成；此外，骨组织的形成和修复与机体其他组织如脂肪组织也有密切关联。因此，本文作者以生物材料植入骨缺损处引起的固有免疫及适应性免疫反应为基础，对骨组织、脂肪组织和免疫系统间的相互作用的最新研究进展进行系统阐述。

骨；生物材料 ；免疫反应 ；微环境 ；骨免疫

生物材料可以模仿正常组织并通过引导骨细胞黏附和增殖，刺激骨缺损部位的骨再生，因而在骨再生领域受到广泛关注。但是，生物材料的植入既可通过免疫反应与机体结合的更为紧密，又可能因慢性炎症反应和异物反应而缺少预期功能[1]。因此，掌握生物材料植入骨缺损引起的免疫反应及其对骨微环境的影响对改进生物材料性质，使其更好的发挥成骨效应具有重要的理论意义。

1 生物材料植入骨缺损引起的固有免疫

生物材料植入骨缺损后，在材料与机体接触瞬间，血液中的细胞间质和蛋白质就吸附于生物材料表面形成临时基质。这层蛋白质决定了凝血系统、补体系统、血小板和免疫细胞及其调节因子的激活，并调节其相互作用，最终导致临时基质形成，启动炎症反应。

1.1 凝血途径启动 生物材料上的凝血作用需要表面激活和血小板的黏附激活作用相结合。研究[2]证实：与生物材料的表面接触可以催化因子XⅡ(FactorXⅡ，FXⅡ)激活为FXⅡa。而FXⅡa激活FXⅠ成为FXⅠa，从而启动内源性凝血途径。血小板的主要激活剂是凝血酶，FXⅡ连接于生物材料，释放较低浓度的凝血酶即可激活血小板，随后血小板释放凝血因子并暴露带负电荷的磷脂，为凝血系统提供了所谓的“催化表面”[3]。凝血酶裂解纤维蛋白原为纤维蛋白，产生生物材料周围最初的纤维网络。纤维蛋白原通过黏附于生物材料表面使构象发生改变，暴露2个整合素的结合位点，通过整合素结合于白细胞并使之活化，在血凝块形成后生理性地产生炎症反应。生物材料上吸附的纤维蛋白原还能作为血小板的黏附基质[4]。除了凝血酶和吸附的纤维蛋白原的作用，损伤的细胞或活化的白细胞中表达组织因子(tissue factor，TF)，TF激活补体，引导与生物材料连接的血小板活化[5]。

1.2 补体在材料表面激活 在生物材料与血液接触后，补体通过一系列作用激活，并发挥清除体内外来物质的宿主防御作用。传统理论认为补体主要通过经典途径、甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin pathway，MBL)途径及旁路途径激活。然而最近的研究结果[6]使这种理论受到了挑战，在血液-材料反应中，补体与各个诱发血栓和炎症的级联系统以及血小板和白细胞间具有紧密的交叉效应，例如：FVⅢ与血管性血友病因子(VWF)的复合体具有凝集素活性；而C1抑制剂(C1INH)不仅可以封闭所有的补体通路，还能封闭内源性凝血通路；补体系统重要的中间产物(如C5a)能够直接由凝血酶产生。

1.3 急慢性炎症反应 在血液-材料反应和临时基质形成后，机体即可发生急慢性炎症反应。炎症程度是由损伤程度、植入部位和临时基质的范围决定的。Reichel等[7]研究显示：在组织和生物材料之间有炎性细胞的募集，早期阶段为多形核中性粒细胞，后期为单个核细胞(如单核细胞和淋巴细胞)。生物材料介导的急性炎症和慢性炎症反应通常是短期而局限的，在急慢性炎症反应后，材料存在的微环境内会含有大量的巨噬细胞和成纤维细胞，而后肉芽组织逐渐形成。在Caetano-Lopes等[8]的慢性炎症动物模型中发生骨密度降低及骨组织模式的改变，这说明炎症反应损伤骨的力学性能，即刚性、延展性和强度，这一结论支持免疫系统影响骨的代谢、结构和功能的假说。Velard等[9]研究发现：羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)颗粒激发了积极的炎症反应,并产生几种对骨内稳态有害的介质，引起破骨细胞活化，导致骨质溶解。细胞吞噬生物材料碎片后释放多种细胞因子，而大多数引起破骨细胞活化的介质是由这些吞噬了材料的巨噬细胞所合成的。

1.4 异物反应 生物材料导致的异物反应有2个主要条件：合适的引导融合的刺激物和有适合蛋白质吸附的材料表面[10]。在血液-材料反应之后，血小板和血凝块释放趋化物，导致巨噬细胞趋向创伤部位。巨细胞脱粒和组胺释放也使巨噬细胞向植入部位聚集并使后期的趋化物增多，引导更多巨噬细胞集中在植入部位[11]。巨噬细胞在聚集之后会通过整合素调节伪足而相互靠近，并相互融合成为异物巨细胞。但导致巨噬细胞融合的确切分子机制尚未完全阐明。有研究[11]显示：多种细胞因子发挥作用，如白细胞介素4(IL-4)、CD44和CD47、树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)、CC趋化因子配体2(CCL2)等。巨噬细胞和异物巨细胞可以在细胞和生物材料间的区域释放降解性介质，如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，降解酶和酸等，这种局限性空间会推迟或减少机体对这些介质的缓冲或抑制作用[12]。

1.5 固有免疫的抑制 目前针对生物材料应用的凝血抑制剂有肝素、凝血酶抑制剂(美拉加群)、TF抑制剂、活化蛋白C和低相对分子质量的硫酸葡聚糖等[13]，但是全身应用凝血系统的抑制剂能够增加出血和感染的风险。而在生物材料或细胞表面应用肝素涂层时可以降低这种风险，同时能够使血浆蛋白仅以特异性或非特异性电荷与生物材料连接，这种连接对血浆蛋白的构象改变较小而不足以被激活。另一种类似的方法是聚乙二醇涂层，其发挥作用是通过增加材料和细胞表面的亲水性，从而阻止蛋白质的吸附，并隐藏材料的表面结构，最终阻断凝血系统的激活[14]。这2种方法的不足之处在于会同时使材料表面完全没有细胞吸附。在抑制补体方面，APT070、因子H、衰变加速因子(decay accelerating factor,DAF)、补体受体2(completement receptor 2,CR2)等补体激活调节剂(regulator of complement activation,RCA)与生物材料混合应用能够减少补体在生物材料表面沉积，并抑制其激活[13]。

2 生物材料植入骨缺损引起的适应性免疫

适应性免疫通过体液免疫及细胞免疫发挥作用，其根本在于淋巴细胞及其分泌的细胞因子。因此，了解生物材料植入后引起的淋巴细胞反应及其对骨微环境的影响具有重要意义。

2.1 单纯植入生物材料 生物材料单纯植入机体时，淋巴细胞反应相对来说并不明显，主要取决于生物材料的抗原性。Rudra等[15]研究显示:螺旋超分子材料在接种动物后激发的抗体反应与其空间构象有关,空间构象复杂的材料可以激发中等程度的抗体反应，而构象相对简单的抗体反应十分微弱。由于干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)和IL-2的产生无明显变化，因此缺少经典的T淋巴细胞活化。Hamdy等[16]研究显示:甘露糖修饰的PLGA-OVA纳米微球相较于无甘露糖修饰的PLGA-OVA纳米微球的抗原性更强，后者激发的CD4+T细胞和CD8+T细胞反应几乎不可测。

2.2 生物材料复合成骨活性成分 当生物材料与细胞、蛋白质或其他具有成骨活性的成分混合时，免疫反应对这些物质的活性会造成一定影响。其中，最主要的问题在于宿主与外源性细胞的相互作用。生物材料载ASCs修复股骨缺损的研究[17]表明：在植入材料2周后CD4+T细胞和CD8+T细胞在材料植入区聚集。T淋巴细胞介导的免疫反应是异体细胞移植失败的主要原因，机制在于外源细胞的同种异体主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子被宿主抗原呈递细胞处理引起CD4+T细胞的同种识别，还能够通过分泌IFN-γ和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导细胞凋亡[17]。在干细胞促骨形成方面，促炎的T淋巴细胞通过IFN-γ降低干细胞内Runx-2通路并增强TNF-α信号，抑制外源性骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)介导的骨修复的能力[18]。

2.3 生物材料对免疫细胞的作用 不同性质的生物材料(如亲水性和正负电荷等)对免疫细胞的作用也不同，因此可以在不改变外源细胞的情况下改变材料性质，使外源细胞保存并发挥功能。同时，生物材料有时具有免疫毒理作用，聚对二氧环己酮-I型胶原(PDO-CI)体外实验表明这种材料对小鼠固有免疫能力没有影响，但是对抗体形成细胞的功能具有抑制作用[19]。

3 免疫系统、骨骼系统及脂肪组织间的作用

在骨髓微环境中，免疫细胞和脂肪细胞是与骨细胞共存，生物材料的植入引起骨髓微环境发生变化，因此可以通过各系统间的相互作用对成骨作用产生影响。

3.1 免疫系统与骨骼系统 活化的T和B淋巴细胞均能够表达核因子-κb受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，诱导自体外周单核细胞形成破骨细胞。但是Onal等[20]在卵巢切除小鼠的研究中显示：由B细胞表达的RANKL在调节骨代谢中具有直接作用：特异性敲除小鼠T细胞的RANKL并没有改变卵巢切除引起的骨流失，但是缺少RANKL表达的B细胞通过抑制破骨细胞局部减少骨流失。抗CD20抗体的治疗效果也突出了B细胞在关节炎发病机制中的作用[21]。此外，Th17由于表达较高水平RANKL及前炎症因子被认为是经典的破骨细胞形成途径。Th17还能表达IL-17，引导基质降解酶(如MMPs)合成，引导骨和软骨降解，而Th1和Th2亚群能通过分泌细胞因子抑制Th17亚群。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)调节这些Th亚群间的平衡，并且通过细胞间接触及细胞因子抑制破骨细胞形成。因此，在病理条件下，T淋巴细胞表达的积极因子和消极因子间的平衡将影响破骨细胞生成[22]。Cain等[23]已经证实：破坏硬化蛋白能够增加B细胞凋亡导致B细胞数目降低。硬化蛋白主要在骨细胞而非任何造血系统细胞中表达，显示骨组织能够通过调节骨髓微环境对免疫系统产生影响。

3.2 骨骼系统与脂肪组织 Zara等[24]研究显示：当骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2 ,BMP2)的浓度适宜时会促进骨形成，而当BMP2浓度较高时，会由于其趋化淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞至骨缺损处从而出现明显的炎症反应，此外还在骨缺损处出现内含脂肪组织的囊样骨。高剂量BMP2可以活化过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)，从而增加c-fos表达，c-fos是破骨细胞形成的基本介质，由此增加破骨细胞生成引起骨吸收。另外，PPAR-γ上调可以直接抑制无翅及小鼠乳房肿瘤病毒结合位点蛋白家族(Wnt)使脂肪形成增加，并抑制成骨细胞产生骨保护素(osteoprotegerin，OPG)，促进BMSCs向成脂方向分化。脂肪组织也可以通过分泌瘦素、脂联素、内脂素和抵抗素等脂肪因子，具有免疫调节作用并与慢性炎症相关。瘦素对骨代谢的作用有2种：一是通过与骨的受体作用，促进前成骨细胞发展并刺激成骨细胞形成新骨；二是通过中枢神经系统降低成骨细胞活性[22]。

4 展 望

生物材料在骨缺损修复应用中要与细胞、蛋白质和其他生物成分混合。在骨缺损区可能会遇到不同于正常组织内的炎症因子和信号分子,使不同类型细胞产生活化、分化、增殖和迁移等不同的反应。材料及其表面的细胞可能会面临低pH值、ROS和降解酶等微环境，从而抑制骨修复。因此，材料工程必须保持材料的性质功能，并保护其中的生物活性物质。另外，生物材料长期存在并发挥功能的关键在于其不引起有害的免疫反应，所以需要设计激发必要免疫学产物的生物材料，随着免疫学与材料学的飞速发展以及两者间的紧密结合，研究者会找到几种相关机制的交叉点，从而支持生物材料的骨缺损修复。

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1671-587Ⅹ(2013)05-1063-04

10.7694/jldxyxb20130541

2013-04-17

国家自然科学基金项目资助课题(30830108)

孙宏晨(1964-)，男，黑龙江省哈尔滨市人，教授，医学博士，高分子化学与物理学博士后，主要从事颌骨重塑机制以及纳米材料与转基因治疗研究。

孙宏晨(Tel：0431-88796010，E-mail：hcsun@mail.jlu.edu.cn)

R318.06

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