地黄饮子加减方对MCAO模型大鼠血浆HPA轴及脑组织HSP70表达的干预效应研究
2013-04-16唐璐孙塑伦高颖朱陵群
唐璐 孙塑伦 高颖 朱陵群
地黄饮子是滋肾阴、补肾阳、化痰开窍的代表方剂，“治喑痱，肾虚弱厥逆，语声不出，足软不用”。本实验中运用的地黄饮子加减方是导师孙塑伦教授从中风病的病机出发，立足肾虚为本，以温补肾阳为主要治法化裁而成，通过观察地黄饮子加减方对大脑中动脉线栓(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠血浆下丘脑—垂体—肾上腺轴(hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA)激素水平及其脑组织热休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)表达的干预效应，探讨了缺血性中风急性期应用温阳补肾法对促进神经功能恢复，改善预后转归的作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
成年SD雄性大鼠30只(北京维通利华实验动物技术有限公司SPF/VAF级，合格证号：SCXK(京)2006-0009)。体重(280±10)g。动物称重编号，用随机数字表法[1]分为正常组，模型组，地黄饮子组，每组10只。
1.2 MCAO模型制备
模型组与地黄饮子组大鼠以大脑中动脉线栓法造模。以10%水合氯醛(0.35mg·kg-1)麻醉后仰卧固定，常规备皮，沿颈部正中线切开皮肤1.5cm左右，钝性分离颈部肌群，以开睑器充分暴露手术野，分离左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)及颈外动脉(external carotid artery，ECA)，结扎ECA及CCA近心端，CCA远心端穿线备用。动脉夹夹闭ECA分叉处。于CCA剪开一个小口，插入头端直径为0.28 mm的栓线。轻轻结扎固定栓线于CCA内，开放动脉夹，将栓线插入颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，使其头端到达大脑中动脉起始处。扎紧固定线，缝合皮肤。术中用100 W灯泡照射，严格控制室温。缝合伤口，清理血迹，将术后大鼠置于电热毯保持体温，直至苏醒。
1.3 药物制备及灌胃方法
地黄饮子加减方配伍及剂量：熟附片4 g、巴戟天10 g、山萸肉10 g、熟地黄12 g、石斛10 g、肉苁蓉12 g、五味子6 g、麦冬15 g。按人与动物体型系数折算，等效比例为7，总生药量316 g。将所有药物用10倍量和8倍量的水煎煮2次，每次1小时，合并水煎液，用旋转蒸发仪浓缩，制成含生药1.0 g/ml的药液备用，pH值7.0。每日称重，按1 ml/100 g的量连续灌胃7天，其中地黄饮子组灌胃中药药液，模型组和正常组灌胃等量的生理盐水，于最后一次灌胃后1小时取材。至取材时模型组大鼠死亡3只，原因为术后腹腔感染、灌胃失误，剩余7只；地黄饮子组大鼠死亡3只，原因为术后腹腔感染、麻醉过量、灌胃失误，剩余7只。
1.4 主要试剂
促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)放射免疫试剂盒、促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)放射免疫试剂盒、皮质醇(cortisol，COR)放射免疫试剂盒均由解放军总医院科技开发中心放免所提供。多克隆小鼠抗动物HSP70试剂盒，SABC、DAB显色试剂盒均由博奥森生物技术有限公司提供。
1.5 指标检测
1.5.1血浆HPA轴大鼠麻醉后经腹主动脉取血4 ml，注入含30 μl EDTA、40 μl抑肽酶的试管中静置，4℃ 3000转/分离心15分钟，取上清液，存-80℃冰箱备用。通过上海核所日环光电仪器有限公司Sn-695B型免疫计数器测定放射强度，记录数值结果。
1.5.2脑组织HSP70表达免疫组化SABC法检测大鼠脑组织HSP70的表达，阳性细胞为细胞核着棕黄色，阴性为细胞核着蓝色。通过安装在OlympusBX60显微镜上的SPO-Ⅱ数码成相软件系统以及Metamorph图像分析软件对HSP70免疫组化染色结果进行拍照分析。以统一的灰度值阈值作为度量标准界定阳性染色部位，采用阳性面积作为测量指标，每只大鼠选5张切片，在20×10，40×10的倍数下，于脑梗死中心区，梗死周边区，对侧正常区随机选取5个视野进行拍照、测量，测定阳性信号平均光密度值，读取数据进行统计分析。
1.6 统计学处理
2 结果
2.1 地黄饮子加减方对MCAO模型大鼠血浆HPA轴的干预作用
正常组、地黄饮子组、模型组的ACTH、CRH、COR各组数据经K-S检验提示均符合正态分布，各组数据经ANOVA方差分析提示总体有差异，以LSD法进行多组间比较，结果显示，在脑缺血发生后7天，模型组的ACTH、CRH含量均明显低于正常组，COR含量明显高于正常组，差异有统计学意义；地黄饮子组的COR明显低于正常组、模型组，差异有统计学意义；地黄饮子组ACTH、CRH含量均明显高于模型组，差异有统计学意义；ACTH、CRH含量略低于正常组，差异无统计学意义。见表1。
表1 各组大鼠灌胃7天后血浆HPA轴含量变化
注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01
2.2 地黄饮子对MCAO模型大鼠脑组织HSP70表达的干预效应
HSP70阳性细胞主要出现在梗塞周边区的皮层,主要为神经细胞,也可见少量的胶质细胞和毛细血管内皮细胞。阳性表达主要在胞质,DAB显色呈棕黄色者即为阳性细胞。模型组仅有少量表达，与模型组比较，地黄饮子组表达显著增加，见图1、图2。
图1 模型组大鼠脑组织HSP70表达 (免疫组化SABC法染色，×400)
图2 地黄饮子组大鼠脑组织HSP70表达 (免疫组化SABC法染色，×400)
正常组、地黄饮子组、模型组脑组织HSP70表达数据经K-S检验提示均符合正态分布，各组数据经ANOVA方差分析提示总体有差异，以LSD法进行多组间比较，结果显示，正常组为阴性，模型组、地黄饮子组脑组织与正常组比较均可见HSP70表达，差异有显著统计学意义(P<0.01)；同模型组相比，地黄饮子组脑组织的HSP70表达更为明显，差异有显著统计学意义(P<0.01)提示地黄饮子加减方可提高SD大鼠脑组织HSP70的表达，在脑缺血急性期发挥脑保护作用，见表2。
表2 地黄饮子对MCAO模型大鼠脑组织 HSP70表达的干预效应
注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01
2.3 MCAO大鼠缺血后HPA轴与脑组织HSP70表达的相关性分析
模型组COR含量与脑组织HSP70表达存在正相关关系，但CRH、ACTH则与HSP70表达无明显相关性，见表3。地黄饮子组HPA轴各指标与脑组织HSP70表达无明显相关性，见表4。
表3 模型组ACTH、CRH、COR含量与HSP70 表达的相关性分析
注：aP<0.01，两个指标显著相关
表4 地黄饮子组ACTH、CRH、COR含量与HSP70 表达的相关性分析
3 讨论
根据本实验结果，地黄饮子灌胃能够改善脑缺血大鼠血浆HPA轴的紊乱状态，通过提高CRH含量抑制大鼠体内COR的释放。这一结果支持了钟历勇、沈自尹等[2-3]提出的补肾药可通过上调下丘脑CRF_mRNA表达来保护HPA轴免受外源性皮质醇的抑制，补肾药对肾阳虚证的主要调节点定位于下丘脑的观点。
热休克蛋白70(HSP70)是一种极敏感和可靠的脑缺血的标志，它是HSP家族中的一种，主要功能是保护各种应激所致的细胞损伤。HSP70对大脑缺血性损伤有保护作用，已有的研究结果证实，它的保护作用机制为：作为分子伴侣，有助于蛋白质的正确折叠；通过直接抑制促细胞凋亡蛋白的功能及间接提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平而抑制细胞凋亡等[4]。另有研究证明，地黄饮子孵育骨髓间充质干细胞移植能够促进大鼠脑梗塞HSP70和神经生长因子VEGF的表达，通过此作用途径发挥脑保护作用[5]。本实验结果说明地黄饮子加减方能够通过促进MCAO大鼠梗死区大脑皮层的HSP70表达，在脑缺血后发挥对机体的保护作用。
有研究者认为梗死后的高糖皮质激素水平是加重病情的一个原因，另有研究发现，MCAO模型大鼠脑组织内HSP70主要位于缺血的半暗带区[6]。HSP70是机体在遭受应激刺激后诱导产生的一组应激蛋白，正常脑内不存在，但可被脑缺血、缺氧等各种损伤迅速诱导产生。模型组血浆COR含量平增高的情况下可加速诱导缺血区HSP70的表达。本研究结果说明，MCAO大鼠经地黄饮子灌胃后，改善了HPA轴的紊乱状态，降低了血浆内COR的含量，提高了脑组织HSP70的表达，通过多途径作用于机体发挥着缺血急性期的脑保护作用。
[1]苗明三.实验动物和动物实验技术[M].第一版.北京:中国中医药出版社,1997:142.
[2]钟历勇，沈自尹，郑仲承，等.下丘脑-垂体-肾上腺轴大鼠下丘脑CRHmRNA表达[J].上海铁道大学学报，1998，19(增刊)：8.
[3]钟历勇，沈自尹，蔡定芳，等. 补脾健身活血三类复方对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴及CRF基因表达的影响[J].中国中西医结合杂志，1997，17(1)：39.
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[6]牛敬忠，王贤军，夏青，等.大鼠局灶性脑梗死后细胞凋亡及热休克蛋白70表达的变化[J].中国微循环，2005,9(3)：179-181.
