脊椎动物父系基因组主动去甲基化研究进展

孙 冰，谢明树，陈松林，赵 文

(1.大连海洋大学辽宁省水生生物学重点实验室，大连116023;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点开放实验室，青岛266071)

在多细胞有机体的发育过程中，不同的细胞和组织需要基因表达的特异性编程。基因表达是由遗传机制和表观遗传机制共同调控的。表观遗传包括对DNA本身的修饰(CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化)和/或与之有关蛋白的修饰(磷酸化，乙酰化和组氨酸甲基化)。这些修饰都可以在不改变DNA序列的情况下调控基因表达［1］。每种细胞都有其特有的表观遗传特征，这样才可以使得基因同源的细胞具有不同的结构和功能。

1 DNA甲基化、去甲基化和遗传外重新编程

DNA甲基化是在不同甲基转移酶的催化下，从CpG二核苷酸的S-腺苷甲硫氨酸中转移一个甲基基团至胞嘧啶残基C5位置上的过程［2-3］。CpG二核苷酸主要存在于与基因相关的CpG岛中，并主要成簇存在于基因的启动子和第一外显子区域。通常认为这些CpG岛位于转录和DNA复制的起始位点，并且在复制起始中代表基因组印迹。基因启动子CpG二核苷酸的甲基化可能会抑制基因表达，这通常是通过干扰其与DNA结合蛋白的接触，或使其与转录抑制因子MeCP2 的结合来实现的［3］。

DNA甲基化是研究最多的一种表观遗传学机制之一［4］，通常具有抑制基因表达，使雌性X染色体失活，调控印记基因表达，使转座因子沉默和调控组织特异性基因表达的作用［5］。在卵子与精子生成过程中，标记与不同甲基化标记等位的母系和父系基因对于调控印记基因的表达具有重要的作用［2］。例如，通过使其中一个X染色体失活并调控组织特异性基因表达，雌性哺乳动物胚胎中DNA的甲基化对于调控X染色体的剂量上具有重要作用。DNA甲基化还有可能使转座因子沉默，其中转座因子对于保持染色体结构的完整性和稳定性具有重要作用［4］。对于基因甲基化状态和与其表达相关性的研究结果表明，由于甲基化而升高或降低的基因转录水平完全取决于在甲基化过程中失活的是正向调控因子还是反向调控因子［6］。

DNA去甲基化过程一般认为分为两类，分别为主动去甲基化和被动去甲基化。主动DNA去甲基化则需要特定的酶反应，而被动DNA去甲基化会抑制复制过程中DNA甲基化转移酶的活力。这两种去甲基化方式包括胞嘧啶取代5-甲基胞嘧啶(5-meC)，或直接去掉5-meC中的甲基基团。被动和主动去甲基化相结合同样也可以造成DNA去甲基化。在这种情况下，被动去甲基化的产物是半甲基化的DNA，最后会变成5-MeC-DNA糖基化酶(5-MCDG)的底物。

在脊椎动物早期全能胚胎和多能生殖细胞的DNA和组蛋白标记中存在大量的遗传外重新编程机制。脊椎动物特定DNA甲基化图式的产生和保持需要DNA甲基化转移酶和结合顺、反式调控子的去甲基化反应之间复杂的相互作用。细胞多能性和胚胎中基因表达的正确起始都可能需要表观遗传重新编程。在脊椎动物已分化的体细胞中，基因组中的甲基化图式通常是稳定的并可遗传的。但在生殖细胞和植入前胚胎中，脊椎动物基因组会经历一种全基因组范围内的甲基化重排过程，并且这两个阶段中出现的重排过程是不同的。在早期胚胎发育阶段中，配子的甲基化标记会被消除(即去甲基化过程)，取而代之的则是对胚胎发育和胚胎全能性具有重要意义的胚胎标记［7］。由此，基因组经历了重新甲基化的过程，基因组DNA在特定的发育时间和在特异的位点上被甲基化，并在胚胎移植时建立了这两种基本的体细胞甲基化图式。DNA甲基化和去甲基化反应对于正常胚胎发育和胚胎印迹所需的特异DNA甲基化图式的形成具有重要作用。

2 父系基因组的主动去甲基化过程

父系基因组中DNA去甲基化是由酶催化的主动过程。受精时，父系基因组交换鱼精蛋白和组蛋白，并且经历需组蛋白修饰的DNA去甲基化，而母系基因组的表观遗传特性看起来则比较稳定。研究发现，精子中高度甲基化的基因在受精后第一轮复制前就被去甲基化了，而来源于卵母细胞的母系等位基因则不受这种重新编程的影响，它们或者保持受精后原本甲基化的状态不变，或者重新进一步甲基化［17］。在植入前胚胎发育过程中，DNA去甲基化是被动的并伴有组蛋白修饰的重组过程。在囊胚期首次出现了表观遗传标记的不同。关于研究去甲基化过程的生化通路的研究结果表明，去甲基化或者是直接去除胞嘧啶核苷酸环C5位置上的甲基基团的过程，这是一种真正的去甲基化;或者是去除整个胞嘧啶核苷酸的碱基(或核苷、或核苷酸)的过程，这是一种间接的去甲基化过程。在体外条件下，甲基结合域蛋白-2(MBD2)参与了5-甲基胞嘧啶中直接去除甲基基团的过程，但在MBD2缺失的受精卵中，其父系基因组去甲基化的过程是正常的［8］。这是因为去除5-甲基胞嘧啶中的甲基基团需要一种可以破坏C-C氢键的高能量，这个过程需要一系列生化反应的参与，并且这种主动去甲基化很可能是间接的。研究表明，这种间接去甲基化机制可能是通过一种碱基切除修复或核苷酸切除修复机制来实现的;或者是由5-甲基胞嘧啶的脱氨基作用(通过脱氨基酶将5-甲基胞嘧啶中的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶)引发［9］，接着由作为胸腺嘧啶DNA糖基化酶和甲基结合域蛋白-4(MBD4)的一些DNA糖基化酶的T:G错配的修复作用实现的。然而，在小鼠受精卵中，在父系基因组中观察到的正常的主动去甲基化过程是缺少MBD4参与的［10］，其主动去甲基化过程是由负责重新甲基化的Dnmt3a和Dnmt3b引发的。在缺失S-腺嘌呤L-蛋氨酸的情况下，这些酶可以将5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶［11］。

很多研究表明母系基因组的被动去甲基化可能是由于缺乏甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，Dnmt1)造成的，但关于父系基因组去甲基化的机制还有很多方面不够清楚。例如，去甲基化过程是否有序列偏好性，在使一些区域免受去甲基化的机制中是否需要一种特定的组蛋白修饰机制参与等问题。另外，关于生殖细胞中一些反映甲基化状态的标记的作用机制一直不够清楚，比如着丝粒上或围绕在着丝粒上的异染色质，单拷贝印记基因，以及LAP逆转录转座子的情况。研究PGC7/Stella-KO(knock out，简称KO)小鼠的受精卵中两种父系印记基因中出现的去甲基化现象的结果表明，最初位于卵质的PGC7/Stella被转移到了父系基因组中，从而保持了使这些印记基因的甲基化状态。此外，在植入前胚胎的发育过程中，母系基因组和受精卵中Dnm1亚型对于基因组甲基化特征的保持具有重要作用。

3 母系基因组不需主动去甲基化的可能原因

从目前对于DNA甲基化重新编程机制的研究结果发现，父系与母系基因组中去甲基化机制的原因和过程是不同的。研究发现，一个卵母细胞可以使一个转移的体细胞核主动去甲基，这表明这种主动去甲基化的活性更可能是存在于卵母细胞中的(而非精子中)。关于受精后只有父系基因组会立即启动主动去甲基化机制的原理尚无定论，但目前有几种可能的解释。

1)在鱼精蛋白与组蛋白转换的过程中，裸露的父系基因组是可以接近去甲基化酶的。

2)通过特异性标记的指引，推导去甲基化酶只对父系基因组感兴趣并发生作用。由于多精入卵的小鼠和人类的受精卵中有许多雄性原核，许多研究结果都支持以上两种假设;而在孤雌生殖的，雌核发育的或三倍体的受精卵中，母系基因组也是没有去甲基化现象的［12］。另外，牛的卵母细胞不会使体细胞核发生主动去甲基化，但在转移了体细胞核的受精卵中观察到了主动去甲基化。在小鼠的受精卵ROSI后则观察到了父系基因组中主动去甲基化的非正常图式。

3)母系基因组受一定机制的保护，可以免受主动去甲基化。研究表明，四周带有甲基化组蛋白的母系基因组可能会保护它们免受不同的细胞质中重排机制的影响，而压缩包装在乙酰化了的组蛋白中的父系基因组则使它们更易于接近可能的去甲基化酶从而发生作用［13］。组蛋白甲基化，特别是 H3K9me2，很可能是通过吸引组蛋白-1连接蛋白来保护母系基因组免受主动去甲基化机制影响的［14］。然而，以下研究证明，组蛋白修饰机制并不是抵抗主动去甲基化的最主要的保护机制。研究表明，小鼠和羊基因组的组蛋白修饰模式是相似的，但在父系基因组中去甲基化的状态则是非常不同的［15］。在敲除了PGC7/Stella的小鼠受精卵的母系基因组中可以观测到主动去甲基化现象，而其组蛋白-3(H3K9meC)的甲基化水平与野生型小鼠的不相上下［16］。基于这些结果可以推断出，作为一种对胚胎早期发育有重要作用的母系因子，PGC7/Stella可使母系基因组不需主动去甲基化。然而，通过记录父系原核中发生主动去甲基化时PGC7/Stella的位置，研究结果表明 PGC7/Stella不在父系原核中，由此推测PGC7/Stella可能与其他因素共同作用来参与保护母系基因组免受主动去甲基化过程。

4 不同脊椎动物的主动去甲基化机制

近年来对于脊椎动物DNA主动去甲基化过程的机制和参与此过程的酶的研究一直从未间断。脊椎动物各物种基因组的DNA甲基化水平是不同的，这反映了各物种中发育动力学的不同。在哺乳动物中，以父系基因组甲基化水平对于母系基因组甲基化水平的相对指数(RM value)来看，物种间原核期受精卵的父系基因组主动去甲基化过程的动力学原理有很大的不同。这种变化性可能意味着父系基因组的主动去甲基化过程并不是哺乳动物发育过程中所必需的，或者每个物种都有自己独特的维持正常胚胎发育的生存策略。研究表明，小鼠受精卵的父系基因组经历了完整的主动去甲基化过程(RM＜0.4)。受精后4 h或交配后10 h，小鼠受精卵的父系基因组就完全失去了甲基化标记。相较于小鼠受精卵的情况来说，大鼠受精卵主动去甲基化的进程可能有着或多或少的延迟。研究表明IVF后10 h或交配后16 h，其相对甲基化水平有了显著下降［17］。另外，利用亚硫酸氢盐测序法，研究发现LINI1逆转录转座子在小鼠胚胎植入前发育时期被去甲基化了，而脑池内类型IAP逆转录重复序列的甲基化状态则保持不变。由此推断，IAP元件与基因组其他组分情况不同，其可以抵抗住去甲基化机制也许具有预防潜在位点不稳定的功能。研究发现，在第一次有丝分裂时，雄性原核基因组在进行复制压缩时被检测到了5mC阳性信号的残留［8］。在胚泡期的中期分裂相中发现了带标记的带着丝粒的异染色质，这表明了在小鼠胚胎植入前期至少有甲基化活动出现。

与鼠科动物情况不同的是，两栖动物非洲爪蟾在受精后较短的一段时间内，其父系基因组中的5-甲基胞嘧啶并不会主动去甲基化。早期胚胎的卵母细胞和精子DNA的高度甲基化水平可以得以保持，但在随后的卵裂发育阶段中这种DNA的高甲基化水平会逐渐下降。所以，在中囊胚转换期(MBT)和随后的原肠胚形成期，非洲爪蟾基因组的甲基化水平是最低的。在非洲爪蟾囊胚和原肠胚期，Irina Stancheva等检测到了单个基因启动子(TFI IIA，Xbra和c-Myc II)甲基化状态的缺失，这些基因可以在MBT期时被激活。然而，重复序列、在MBT期时不活跃的基因或单个基因的编码区的甲基化图式不变。在缺失甲基转移酶xDnmt1的胚胎中，甲基化启动子的发育上的程序化变化被破坏了，这可能是由于发生在这些胚胎中的基因表达图式发生了改变。这些研究结果表明，在非洲爪蟾中，DNA甲基化对于调控在MBT期内基因活化的时机方面有重要作用［18］。

利用斑马鱼胚胎，Kunal Rai等利用一种5-meC脱氨基酶(简称AID，此酶可将5-meC转化为胸腺嘧啶)和一种G:T特异性错配的胸腺嘧啶糖基化酶(Mbd4)相结合的方式为揭示体内去除5-甲基化胞嘧啶(5-meC)机制的原理提供了重要依据。甲基化的DNA注射到斑马鱼胚胎中，激发胚胎产生了一种强烈的DNA去甲基化活性，此活性在去除AID或缺少Gadd45酶因子的情况下会有所降低。值得引起注意的是，在体内过表达这种脱氨基酶/糖基化酶对(AID/Mbd4)可以引起大部分基因组以及注射进入胚胎的甲基化的DNA片段的去甲基化作用，这很有可能是由于G:T错配的作用。敲除AID或Mbd4可以引起普通基因的一系列重新甲基化作用。另外，Gadd45可以促进去甲基化作用和脱氨基酶/糖基化酶对的功能性的相互作用。5-meC去甲基化是一种耦合反应，即AID使5-meC发生脱氨基作用，接着Mbd4在Gadd45的促进下切除胸腺嘧啶来完成整个去甲基化反应［19］。

综上所述，脊椎动物物种之间父系基因组去甲基化方式的不同可能是由于卵子胞质去甲基化活力的不同。然而，即使是公认的父系基因组部分去甲基化的绵羊、山羊和兔中，仍有一定比例的受精卵的父系基因组是完全去甲基化的。利用种间显微授精的方法，绵羊受精卵可使小鼠精子染色质中出现主动去甲基化现象［20］。另外，不同物种中精子染色质结构的不同可能是造成物种间父系基因组去甲基化方式不同的另一个原因。相对于绵羊、山羊和兔来说，小鼠和大鼠受精卵胚胎的基因组中经历了一种早期活化过程(由母系至父系的过渡过程)［21］，所以对于小鼠和大鼠来说，父系基因组的主动去甲基化可能是保证胚胎基因组具有正常转录活性的一个重要原因。

5 影响主动去甲基化的因素

目前普遍认为，卵子的胞质是导致父系基因组去甲基化的主要因素。卵细胞质的功能可能会受到卵母细胞质量或胚胎受精后早期培养条件的影响。研究表明，不论是体内成熟的猪的卵母细胞，还是在胚泡破裂前在体内成熟的、接着体外培养至细胞分裂中期-II期的猪的卵母细胞，它们支持父系基因组进行主动去甲基化的能力都比体外成熟的卵母细胞的高。在小鼠和大鼠中，体外培养来自体内的受精卵会削弱其主动去甲基化的能力［22］。

父系配子的性能也可能会影响主动去甲基化的效率。研究表明，小鼠受精卵可以通过试管受精(IVF)，卵胞浆内单精子注射术(ICSI)和圆形精子细胞显微注射术(ROSI)等方式获得［23］。在小鼠中，IVF和ICSI都不会影响主动去甲基化的动力学，但ROSI会使去甲基化过程不正常，例如去甲基化程度不足或引发重新甲基化。所以可以推测的是，父系配子的性能可能会影响主动去甲基化的效率。此外，ROSI后胚胎发育不完整可能由于以下两种情况，即父系去甲基化图式不正常，或雄性原核的核原生质中甲基化的染色质定位不正常，而并非由于父系去甲基化不完全所致。另一方面，不论ICSI或ROSI技术成功诞生了多少后代，大鼠胚胎的体外生产都不如小鼠的有效。通过IVF和ICSI技术得到的大鼠受精卵中父系基因组中出现主动去甲基化的时间基本相似，即受精后6～10 h，但相较于体内受精的受精卵来说，去甲基化的程度较浅。然而，ROSI并不会使大鼠受精卵父系基因组的去甲基化程度减轻［24］。

另外我们应该注意到，在牛这个物种上进行的去甲基化研究都是利用源于体外成熟的以及体外受精的原核受精卵。考虑到细胞质的成熟状态是不同的(可作为一种预测发育能力的参数)，如果利用源于体内的受精卵或选择体内成熟的卵子进行受精来研究这个现象的话，得到的主动去甲基化机制的结果可能会发生改变。例如，在猪中，在体内受精卵中观察到完全去甲基化现象，而在体外受精的受精卵中却没有观测到去甲基化现象。

6 展望

本文综述了脊椎动物原核期受精卵中父系基因组的主动去甲基化过程。其更加深刻的分子机制，脊椎动物各物种间出现这种去甲基化现象差异(出现与否及程度不同)的原因，以及母系基因组与父系基因组对于主动去甲基化的不同的反馈机制等问题仍待进一步研究［25-26］。理解父系基因组主动去甲基化的机制会使许多问题有所突破。例如，利用不成熟精细胞进行的显微授精的成功率较低［27］，或非正常的遗传外重排机制引起体细胞核移植的成功率较低［28］。目前关于转基因水产动物的研究中，转基因定点整合，外源基因稳定表达和遗传，胚胎发育异常等问题是转基因研究有待克服的重点和难点。从外源基因表达的表观调控机制(尤其是表观遗传重编程的异常现象)来看，在甲基化水平变化最强烈的配子形成和早期胚胎发育阶段中，若去甲基化不足或过早进行重新甲基化，都会导致胚胎发育异常甚至死亡。理解脊椎动物父系基因组去甲基化的机制可以为解决转基因克隆水产动物中普遍存在的难点问题提供理论依据，有利于转基因克隆技术的更好应用。研究胚胎发育过程中的表观遗传调控机制，对于优化体外胚胎发育条件以及提高体外胚胎生产效率有着重要意义。

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