开设“改善单链抗体亲合力的分子结构改造”特色实验课的体会

朱建国，林 源，李本强

(上海交通大学 农业与生物学院 上海市兽医生物技术重点实验室，上海200240)

0 引 言

抗体(Antibody)是疾病治疗诊断中最有力的工具之一，也是迄今为止检测和治疗分子中发展最快的一类功能性分子。基因工程技术已经将抗体研制技术推向第三代基因重组抗体阶段［1］。其中的单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)由于具有分子量小、易于基因操作改造、在特定医学应用中拥有多种有利性质、便于经济有效的生产等特点，显示出比传统单克隆抗体(mAb)更大的优势，是第三代抗体的重要代表［2］，其相关的理论和技术也应该是生命科学学科领域学生重点掌握的知识。

“动物生物技术综合实验II”是一门涵盖以现代免疫学、分子生物学等学科原理和技术为基础的动物疫病综合防治技术实验课程。该课程中的一些实验内容在教学过程中被证明设置不科学或与其他课程内容重复，需要设置更为科学合理的实验内容对其进行更新。

本课题组多年来一直从事单链抗体技术研究，成功构建了单链抗体库，并筛选得到了多个针对传染性支气管炎病毒(IBV)以及新城疫病毒(NDV)等的单链抗体［3］。随着研究的深入，我们也发现了单链抗体构建技术中的一些新问题，譬如抗体分子亲和力不高、稳定性较差等。这些是书本上找不到现成解决方法的共性问题［4］，需要在实验中引导学生探索研究新的解决方法。为此，我们申报上海交通大学特色实验项目“改善单链抗体亲合力的分子结构改造”，目的是在本科生所能承受的技术层面内，研究制定切实可行的实验内容和方案，替代现有的设置不科学的实验课内容，以期通过实验，使学生掌握抗体分子结构与其亲合力的关系的基本原理以及通过结构改造改善抗体分子功能的基本技术［5］。这将对增强学生对生物技术的好奇心和兴趣，启发学生科研创新意识，培养学生的科研能力发挥重要的作用。

1 实验目的

通过实验，让学生掌握抗体分子结构与其亲合力的关系的基本原理，掌握氨基酸置换对抗体片段亲和力影响的基本原理以及PCR 点突变、基因碱基置换的基本技术方法［6］，从而对通过结构改造改善抗体分子功能的基本原理和技术有一个全面系统的认识。这将对增强学生对生物技术的好奇心和兴趣，启发学生科研创新意识，培养学生的科研能力发挥重要的作用。

2 实验内容

整个实验项目由3 个实验组成，每个实验安排3学时，共需9 学时。

(1) 实验一 改善单链抗体亲和力的置换碱基确定及PCR 引物设计实验。分析本实验室构建的单链抗体ZL.10 的基因序列，确定为提高抗体亲和力需要置换的氨基酸，按照点突变PCR 的原理设计两对引物［7］，用于对重链CDR3 301-303 碱基和307-310 碱基进行突变。

(2) 实验二 点突变单链抗体基因扩增及其重组表达质粒构建实验。利用引物设计在突变的scFv 基因两端加入酶切位点(NcoI 和NotI)，通过PCR 扩增法对scFv 基因实施点突变并最终获得点突变的scFv 基因，分别用限制性内切酶NcoI 和NotI 对scFv 基因和载体质粒进行双酶切，使其产生相同粘性末端，利用大肠杆菌T4 连接酶，将酶切后的scFv 基因和载体连接［8］。

(3) 实验三 点突变单链抗体表达及亲和力测定分析实验。对含有scFv 的重组表达质粒的阳性克隆进行培养，再加入诱导剂诱导蛋白表达。收集菌体，利用渗透休克法提取细胞周质中的表达的单链抗体，用ELISA 实验检测表达的单链抗体与抗原的结合强度，以分析比较氨基酸置换前后单链抗体的亲和力［9］。

3 取得的教学效果

(1) 形成一种科研教学动态运行模式。本项目选题来自本课题组多年来一直从事单链抗体技术研究的实际项目。本课题组经过多年的PRP 与本科生科技创新和毕业设计的教学实践，在特色实验教学方面形成了一定的工作积累。在多年的教学和科研相结合的实践中，我们团队注重探索由任课老师、博士研究生、硕士研究生和本科生组成的结构合理的科研教学动态运行模式。通过本项目顺利实施，说明我们探索的由科研团对承担本科教学实验的运行模式是成功的［10］。

(2) 改善了现有实验课程的内容。本课题组开设本科生“动物生物技术实验2”课程，教学效果良好。但随着课程运行，我们发现一些实验内容已经不能适应学科发展的需要，需要用新的实验内容替代现有的设置不科学的实验课内容，本课题组正是基于在该课程教学实践过程中对课程建设内容的理解和把握，将本实验项目分为9 个学时合理地镶嵌在“动物生物技术实验2”课程中，使得该课程教学效果大为改善。

(3) 全面提高了学生的科学素养及科研能力。实验方案设计能充分考虑本科生所能承受的技术能力，且有利于激发学生创新意识和能力。通过这一完整、具体科研项目的科研过程的参与，使学生从科研项目立项可行性论证、实验方案设计、实验操作、结果分析讨论等环节有一个全面系统的体验和锻炼［11］，全面提高了学生的科学素养及科研能力。

4 结 语

(1) 验证性实验改为探索性试验，有利于激发学生的科研兴趣和创新意识。在充分考虑学生所能承受的专业理论和技术能力的前提下，从课题组实际科研项目中需要探索的项目中凝练出一个小型科研项目，拟解决的问题都是书本上找不到现成解决方法的共性问题，需要在实践中引导学生探索研究新的解决方法。实践证明，当学生知道他们要做的实验是探索一种未知的东西时，非常兴奋。让学生实际体验创新乐趣，更能激发学生的好奇心和探索精神，对于启发学生科研创新意识，培养学生的科研能力具有重要的作用［12］。

(2) 正式实验和预备实验相结合，力求完整系统。本实验是一个系统的小型科研项目，实验内容完整系统，但由于本科生教学计划的实际需要，本项目只能安排9 学时，而且分割成三次实验，每个实验间隔一周，跨度大，内容不连贯，难以衔接，不利于学生对整个实验过程的整体把握。所以我们探索出一个正式实验与预备实验相结合的运行模式，特别抓预备实验环节［13］。即每次正式实验开始前，每个小组至少有一个学生提前到实验室准备实验，而正式实验结束后，至少有一个学生负责观察结果，确保学生前后连贯地熟悉整个实验过程，由两个博士生全程担任助教。这种由任课老师师、博士研究生、硕士研究生和本科生组成的结构合理的科研教学团队动态运行模式，对于这类实验运行特别有效。

(3) 注重考核环节，确保教学质量。除了各个环节认真把关外，特别注重通过实验报告考察学生的掌握能力［14］，老师每次都要认真点评上一次的实验报告，让学生针对实验中出现的问题及时进行讨论，谈实验体会，能清醒地认识本科生的实验能力。在方案设计方面能充分考虑学生所能承受的技术能力，既能保证实验按照预期结果完成，又善于激发学生创新意识和能力［15］，取得了较好的成绩。

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