生物燃料生产中微生物的有机溶剂耐受机制

曹小龙，田 云，卢向阳

（1．湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙410028；2．湖南省农业生物工程研究所，湖南 长沙410028）

面对能源日益枯竭、环境不断恶化、温室效应日趋严重等问题，绿色可持续发展的生物能源受到了广泛重视，其中燃料乙醇被公认为是最有发展前景的可再生清洁能源之一。木质纤维素是燃料乙醇生产中最具潜力的原材料，其转化生成生物燃料的过程主要分为3步：预处理、糖化和发酵，其中最重要也最困难的是糖化过程，即将致密的生物质原材料分解为可发酵的还原性单糖。预处理方法主要有酸水解、碱水解、蒸汽爆破法、超声波破碎法、氨纤维爆破法等。

预处理虽然可以很好地降低纤维素聚合度，但会产生很多对细胞有毒害作用的物质，主要有以下3类：（1）弱酸，包括乙酸、甲酸、乙酰丙酸等；（2）呋喃醛类，主要是糠醛和羟甲基糠醛；（3）酚类化合物［1］。除了预处理过程产生的有毒物质外，发酵产物的积累也会对细菌产生一定的毒害作用，最终降低生物燃料的产量。有机溶剂毒性主要体现在：提高了细胞膜的渗透性和流动性，降低了能量转移势，破坏了膜蛋白的功能等等［2］。当细胞膜的渗透性提高时，细胞内pH值控制受到影响，胞内大分子（如RNA、磷脂和蛋白质）向外渗透，严重威胁细胞的生长及存活；细胞膜流动性的提高会改变其结构和稳定性，能量势的降低则直接影响到各项生理活动的正常进行，甚至导致细胞死亡。有机溶剂的毒性大小与其极性密切相关，logP值在1～4之间的有机溶剂易溶于水，易进入细胞膜，对细胞危害极大［3］。

当外界环境中存在有机溶剂时，非耐受菌细胞膜会遭到破坏，生理功能受到影响，甚至死亡，耐受菌则会作出相应的改变来适应这种环境［2］。微生物耐受性的研究，对生物燃料生产、生物医药开发、环境污染治理等都有着巨大的应用价值。作者在此重点介绍微生物对有机溶剂的耐受机制，包括细胞膜的改变与修饰、输出泵的作用、热激蛋白、转化和降解等等。

1 细胞膜的改变与修饰

细胞膜作为屏障在维持细胞内环境的稳态、保持细菌的正常代谢、在细胞与环境之间进行物质运输、能量交换和信息传递的过程中起着决定性的作用。研究表明，在微生物耐受性方面，细胞膜发挥着关键作用，主要机制有：脂肪酸饱和度的增加、脂肪酸极性头部基团的改变、不饱和脂肪酸的顺反异构变化、长链脂肪酸含量增加、新合成一些正常条件下不能合成的脂肪酸等。

1．1 脂肪酸饱和度的变化

饱和脂肪酸相对于不饱和脂肪酸有更高的相转变温度，因此，细胞膜中饱和脂肪酸含量以及酯酰基的增加，可以提高膜的稳定性［4］。侯雪丹等［5］从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）出发，筛选获得乙醇耐受菌株 Y－c－8和丙酮耐受菌株 B－g－5，分析发现 Y－c－8中油酸和亚油酸含量从出发菌的19．24%和0%提高到了26．69%和48．90%，B－g－5中油酸和亚油酸含量分别高达21．87%和52．57%。杨洁等［6］用LC－MS方法分析乙醇发酵过程中酿酒酵母的总磷脂的变化情况时发现，随着酵母细胞由调整期进入对数期，含有不饱和长链的磷脂分子含量减少，含有饱和短链的磷脂分子含量显著增加。Oh等［7］在Escherichia coli基因中敲除一个参与饱和脂肪酸降解和不饱和脂肪酸合成的基因fad的抑制基因fadR，发现细胞膜上各种饱和脂肪酸含量都大幅增加，耐受性也相应地得到了提高。通常认为：饱和脂肪酸的增加可以降低细胞膜的流动性，有利于细胞膜的稳定，对提高细胞的耐受能力有很好的作用。但饱和脂肪酸的合成需要从头开始，并且是一个耗能的过程［8］，因此，脂肪酸饱和度的改变，被认为是一种微生物耐受有机溶剂的长期机制。另外，个别情况下，脂肪酸饱和度的增加提高了细胞的耐受性，但其乙醇产量并没有相应提高，说明耐受性和乙醇产量并非简单的线性关系［9］。

1．2 脂肪酸极性头部基团的变化

在革兰氏阴性菌中，磷脂极性头部基团的种类和与之相连的脂肪酸长度都会影响到细胞膜的流动性。脂肪酸的磷脂极性头部基团主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和心磷脂3种，且每一种的相转变温度不同，其中心磷脂的最高，在细胞膜中最稳定。磷脂极性头部基团的改变在P．putida中比较普遍。溶剂耐受菌P．putida DOT－T1E经过甲苯耐受处理后，心磷脂含量从12%上升到25%，磷脂酰乙醇胺含量从78%下降到63%，磷脂酰丝氨酸含量基本保持不变，同位素示踪法发现90%的32P整合到心磷脂中［10］。而且，有机溶剂的logP值越低，心磷脂的含量越高，磷脂酰乙醇胺的含量越低［11］。由此可以推断，当遭遇高有机溶剂环境时，细胞膜上磷脂中稳定性高的极性基团含量增加，稳定性低的极性基团含量减少，最终提高了细胞膜的稳定性。

1．3 不饱和脂肪酸的顺反异构变化

在细胞膜中，顺式和反式不饱和脂肪酸以一定的比例存在着，而且顺式不饱和脂肪酸的含量远大于反式脂肪酸。在顺式不饱和脂肪酸中，双键两侧的酰基链夹角较大，使膜脂排列相对疏松；而在反式不饱和脂肪酸中，酰基链夹角很小，细胞膜排列紧密、有序，有较强的稳定性，可以很好地阻止溶剂进入膜内。在有机溶剂刺激下，通过顺反异构酶（cti）的催化将不饱和脂肪酸由顺式转变为反式，可以降低细胞膜的流动性和提高溶剂耐受性［2］。Bernal等通过荧光偏振实验发现cti基因缺陷突变株的细胞膜致密性不及野生型，而且该基因是单顺反子，在对数期和稳定期的表达水平都比较低［12］。还有研究发现，在培养基中加入甲苯后，溶剂耐受菌P．putida DOT－T1E在1min内即发生顺反异构，与加入甲苯前相比，最终顺反脂肪酸比例从7．5下降到了1［10］。

顺反异构是一个不需耗能的反应，能够迅速有效地进行，因此，其很可能是细胞耐受机制中最先起反应的过程。有人发现顺反异构现象在其它环境（如重金属、高温、低pH值等）下也普遍出现，说明这种机制可能是细胞应对胁迫的一般防御机制［11］。

2 输出泵的作用

细胞膜作为细胞的第一道防御屏障，并不能阻挡所有的有机溶剂，当溶剂进入细胞后，会产生相应的破坏作用，面对这种情况，耐受性微生物会通过与能量偶联的输出泵机制将胞内的溶剂排出，保证其正常的生理环境，该现象普遍出现在革兰氏阴性菌中。

输出泵是能利用质子动力势将胞内溶剂排出的膜蛋白，由3个功能不同的部分组成，内膜蛋白负责底物识别和质子逆转运，胞质连接作为内膜泵之间的桥梁，外膜蛋白作为输出通道，三者缺一不可［2］。目前，已经发现大量功能各异的输出泵，这些输出泵能将包括丁醇、甲苯、苯乙烯、己烷、庚烷、辛烷、抗生素和其它烃类在内的多种物质排出胞外，并提高细菌的耐受性。当前研究得最透彻的是RND家族（Resistance－nodulation－division family）的输出泵，例如，P．putida DOTT1E的3个输出泵（TtgABC、TtgDEF和TtgGHI）能有效地从细胞膜上泵出甲苯、苯乙烯、乙基苯和丙基苯4种溶剂［13］；来自大肠杆菌的输出泵acrAB－tolC能够将己烷、庚烷、辛烷和壬烷等排出胞外［14］；任静朝等［15］在志贺菌中也发现了输出泵acrAB－tolC，并证实了该输出泵能很好地将某些有机溶剂和抗生素排出胞外。

利用基因手段构建工程菌，对于提高细菌的耐受性和燃料产量是非常有前景的。Dunlop等［16］利用生物信息学方法，在数据库中发掘到了43个输出泵基因，并将其在大肠杆菌中表达，用7种常见的有机溶剂分别测试其耐受性，发现43株工程菌对丁醇和异戊醇的耐受性都没改变，而对其它5种（Geranyl acetate，Geraniol，α－Pinene，Limonene，Farnesyl hexanoate）有机溶剂的耐受性均有显著提高，且生物燃料产量也大幅提高。

3 热激蛋白

热激蛋白（Heat shock proteins，HSP）也被称作分子伴侣，是细胞在外界物理化学刺激下产生的一类蛋白质，在胞内蛋白质的合成、转运、折叠和降解过程中起重要作用［17］。按照蛋白的大小，可分为5类，分别为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子热激蛋白［18］。热激蛋白最先是在果蝇中发现的，受热刺激后合成量显著增加，之后，发现其还能受溶剂、紫外线、机械损伤等诱导。

热激蛋白在溶剂胁迫下，能够阻止蛋白质聚集，并协助其重新折叠，并最终提高耐受性［2］。目前，已经在大肠杆菌、乳球杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌、酿酒酵母等微生物中发现了热激蛋白的存在，而且不断有人通过基因工程手段将热激蛋白基因转入溶剂生产菌中成功构建溶剂耐受菌。Tomas等［19］发现热激蛋白Gro－ESL过表达可以降低丁醇对C．acetobutylicum的抑制，后续实验也证实GroESL过表达可以引起一系列热激蛋白基因（包括dnaKJ、hsp18、hsp90）表达的提高。Zingaro等［20］在大肠杆菌中插入热激蛋白基因构建各种半合成胁迫应答系统，同时超表达热激蛋白GrpE和GroESL后，工程菌在5%（体积分数，下同）乙醇中24h后的活力是出发菌的3倍；同时超表达GroESL和ClpB共存质粒后，工程菌在5%乙醇、1%正丁醇和1%异丁醇中24h后的活力较出发菌分别提高了1130%、78%和25%；同时超表达GrpE、Gro－ESL和ClpB的单质粒后，工程菌在7%乙醇、1%正丁醇和25%1，2，4－丁三醇中24h后的活力较出发菌分别提高了200%、390%和78%。这些均表明热激蛋白在微生物耐受性方面发挥着巨大的作用。

热激蛋白基因的表达往往受特定的转录因子和σ因子的调控，其中最重要的是革兰氏阴性菌中的σB和芽孢杆菌中的σS，但其具体调控机制还不清楚［17］。总的来说，热激蛋白可以通过修复损伤蛋白质而起到提高细胞耐受性对抗细胞死亡的作用，并且能有效提高生物燃料产量。

4 转化与降解

在有毒溶剂进入细胞后，细胞还会产生相应的酶系，将有毒溶剂降解为低毒或无毒的小分子物质，排出胞外或加以利用。P．putida DOT－T1E可以在90%（体积分数）的甲苯培养基中生存，主要是因为胞内甲苯双加氧酶将甲苯氧化成了3－甲基儿茶酚，并最终进入柠檬酸循环，通过降解甲苯，消除抑制作用，从而维持正常的生理代谢［12］。最近，Dai等［21］在 Clostridium acetobutylicumRh8菌株基因组中插入一个来自ClostridiumbeijerinckiiNRRL B593的次级醇脱氢酶基因（sADH），由thl启动子控制，发现该基因过表达后，Rh8的醇耐受性显著提高，而且在以31．42%葡萄糖发酵过程中，总醇的产量也提高至23．88g·L－1（异丙醇7．6g·L－1、丁醇15g·L－1、乙醇1．28g·L－1）。这表明，相应的降解酶系可以提高微生物对有机溶剂的耐受能力，并最终提高生物燃料的产量，同时，也证明了基因工程手段在提高微生物耐受性的应用中意义重大。

5 其它耐受机制

除了以上这些研究得较多的耐受机制外，耐受微生物中还存在一些报道较少的机制，像比表面积的改变、囊泡外排、脂多糖等。Neumann等［22］报道耐受菌P．putida P8在芳香族化合物（如苯酚、4－氯苯酚）存在时，其细胞体积明显增大，且溶剂浓度越大，体积变化越显著，同样的情况在Enterobacter sp．VKG H12遇到正丁醇时也能观察到。这说明，在遇到溶剂胁迫时，细胞能够通过降低其比表面积以减少溶剂对胞体的伤害。另外，Kobayashi等［23］发现 P．putida IH－2000在加有甲苯的培养基上生长时，会产生大量的囊泡，且囊泡会从细胞膜上释放出来，囊泡中的甲苯浓度远高于细胞膜上的甲苯浓度，说明该菌通过形成囊泡将胞内的有毒溶剂排出胞外。

微生物体内存在多种耐受机制，这些机制往往不是单独起作用，而是多种机制共同作用以应付复杂的生存环境。Sandoval等［24］分别取有机溶剂存在时和不存在时的大肠杆菌基因组构建文库，分析后发现一系列与细胞膜和胞外进程相关的基因表达发生了变化，并产生特异的氨基酸和核苷酸，表明耐受性涉及多条途径。多种耐受机制的存在，使细胞对溶剂的耐受性大大提高，保持了菌株的活性，一定程度上也提高了生物燃料的终产量。

6 结语

在生物燃料的生产过程中，产物的积累会抑制微生物和酶的活性，并最终影响其产量，应对措施主要有两个方面：一是及时从反应器中除去产物以解除抑制作用，其方法主要包括气提、液提、渗透蒸发、渗透萃取等；二是通过菌种筛选、菌种驯化、诱变、基因改造等方法提高菌种的耐受能力，使之能在高浓度的有机溶剂条件下正常生长。微生物的有机溶剂耐受机制多种多样，主要分为通过细胞膜的防御作用阻止毒性溶剂的进入、通过输出泵将已经进入胞内的溶剂排出、通过胞内降解酶系将未能及时排出的有毒溶剂分解等三个方面，因此，提高微生物有机溶剂耐受性的方法也可以从针对这三个方面着手，包括从高浓度溶剂污染的自然环境中筛选耐受菌，在宿主菌株中转入相应的热激蛋白基因、输出泵基因、高耐受性脂肪酸膜基因等以构建新的高耐受性的工程菌等。

有机溶剂对微生物的作用并非绝对的，研究发现，在适当的浓度下，有机溶剂也能促进微生物的生长，并最终提高生物燃料产量。例如，法尼烯等生化柴油和脂肪酸衍生物燃料在适当的浓度下不会抑制细胞的生长［2］；在酿酒酵母乙醇发酵过程中，低浓度的弱酸（＜100mmol·L－1）甚至可以提高乙醇得率，而在高于这一浓度时，乙醇得率则会降低［25］。

高有机溶剂耐受能力的菌株在生物燃料生产、生物修复、生物医药、污水处理、酶制剂开发、全细胞生物催化等领域有着巨大的应用价值，但溶剂输出泵的具体作用机制、革兰氏阳性菌的耐受机制等相关研究都还需要进一步的深入。

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