海洋微生物固氮作用研究进展

周海霞，刘其友，郑经堂

（中国石油大学（华东）化学工程学院，山东 青岛266580）

氮元素是海洋初级生产力的主要限制因素。海洋中氮元素的补充有三条途径：（1）陆源输入，氮营养盐从土壤中被溶淋出，经由河流、湖泊进入海洋生态系统。这一过程主要影响河口地区和近海，增加水体等的富营养化；（2）空气中的氮经过闪电和宇宙射线辐射转化为少量可溶性氨；（3）海洋微生物的固氮作用，即海洋微生物在固氮酶作用下将N2催化还原为。具有固氮作用的微生物不仅能够通过固定N2来支持自身生长，还能通过细胞分泌等过程向环境释放结合态氮，从而缓解周围的氮限制[1］。在海洋环境中，微生物固氮作用经过长期进化给海洋环境提供了新的氮源，对于增加寡营养海域的新生产力具有重要生物学意义。

1 海洋固氮微生物的种类

随着人们对固氮微生物研究不断深入，发现了越来越多的新的种类。从最初的只能检测到个别微生物具备固氮能力，发展到利用乙炔还原法和同位素标记[2］检测许多微生物能够进行固氮，直至利用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术检测固氮酶基因nifH或nifHmRNA，极大地拓展了人们对固氮微生物多样性和固氮活性的认识。目前已知的固氮微生物均属于古菌域和细菌域[3］，还没有发现能进行固氮的真核微生物。根据微生物的生理特点和生物种类，可将固氮微生物分为不同的生理类群和生物类群。

1.1 固氮微生物的生理类群

按照固氮菌和其它生物的生理关系，可将固氮微生物分为三种主要生理类型[4，5］：自生固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌。固氮是厌氧过程，但某些微生物在固氮的同时仍然产生氧气，按照微生物在固氮时是否有氧气产生，还可将自生固氮菌分为好氧性自生固氮菌和厌氧性自生固氮菌。

自生固氮菌是能够独立生活并固氮的微生物。1961年，Dugdale等[6］进行海洋Trichodesmium 固氮研究，通过示踪证实了它具有固氮能力。后续研究表明Trichodesmium是海洋中重要的固氮微生物之一。

联合固氮菌是能够独立生活的固氮微生物，通过定植于植物根系表面或附近土壤或侵入植物根部，依靠植物根系分泌物生长，同时提供固定的氮满足植物生长需要，二者形成松散的共生关系。海草Zostera marina根系周围的沉积物能够刺激微生物固氮活性，再通过氮转移获得海草生长需要的氮源。固氮微生物和海草的生长之间是相互促进的关系，研究表明多糖和藻酸盐等能够使沉积物固氮速率提高几倍到上百倍[7，8］。

共生固氮菌是必须和另一种生物密切生活在一起才能进行固氮的微生物，二者生存关系密切，单独生活时不能进行固氮。固氮菌通过固定氮获得氨基酸和蛋白质，然后提供给共生生物，同时从共生生物那里获得必需的碳源和能源[9］。能与固氮微生物共生的海洋生物有珊瑚、海绵、船蛆、硅藻等[10］。

1.2 固氮微生物的生物类群

Zehr等[3］在2003年将含有nifH 固氮基因的微生物进行分类整理，得到10个门或者纲（Group），共67个属，广泛分布在原核微生物中。这说明固氮能力对微生物来说十分重要。Dos Santos等[11］用6种固氮酶基因编码的产物NifHDK和NifENB搜索所有的微生物基因组序列，结果获得13个细菌门和1个古菌门，共109个属，149个种，其中82个种是已知的固氮微生物，67个种固氮能力未知。作者从GenBank中搜索含有nifH基因的微生物，共得到116个属，比Zehr等[3］在2003年统计的固氮微生物种属增加了近1倍，这说明10年间人们对固氮微生物的研究取得了前所未有的进步。

2 固氮基因的多样性

PCR技术推动了微生物生态研究走向分子阶段。该技术不依赖于活的微生物，更不需要检验微生物的功能活性。采用PCR技术发现了大量未知的不可培养微生物。对极端环境、海洋水体、深海沉积物以及甲烷水合物区的固氮基因nifH的研究，极大地丰富了人们的视野，加深了对固氮微生物和氮循环重要性的认识，使人类对固氮微生物的了解从肤浅走向深入。

固氮酶横跨古菌域和细菌域，分布极其广泛，说明固氮功能在微生物中普遍存在，同时也说明这一功能的重要性。固氮基因广泛存在但是进化上却具有保守性，为采用PCR技术扩增固氮基因nifH、分析环境中大量存在的不可培养的固氮微生物奠定了基础。随着研究的深入，对NifH系统发育多样性的认识也逐步增加。2003年，Zehr等[3］通过构建 NifH 和16S rRNA系统进化树对固氮基因和微生物种群进行比较，认为固氮基因和固氮微生物种类存在一定程度上的一致性，在系统发育树上可以找出一一对应关系。

早期的研究认为，nifH基因基本上有4个Cluster，Cluster I基因主要来自α－变形菌纲、β－变形菌纲、γ－变形菌纲、蓝细菌以及γ－变形菌纲的vnfH 基因；ClusterⅡ是产甲烷微生物的固氮酶和细菌anfH基因；ClusterⅢ是厌氧细菌的固氮酶基因，例如梭菌（G＋C含量低，G＋）、硫还原细菌（δ－变形菌纲）；ClusterⅣ是各种来自古菌的固氮酶基因，和16SrDNA的分类有一定的相似性[3，12］。

2003年，Mehta等[12］用nifH 基因的一对扩增引物：正向引物forward（5′－GGHAARGGHGGHATHGGNAARTC－3′，对应10～17位氨基酸 GKGGIGKS，是铁蛋白上ATP的结合位点）和反向引物reverse（5′－GGCATNGCRAANCCVCCRCANAC－3′，对应132～139位氨基酸VCGGFAMP，包含4Fe－4S簇配位体上的半胱氨酸），从深海和热液喷口获得的77个NifH，系统发育关系显示也分成4个簇。

2004年，Steward等[13］用两对引物：CDHPnif53F（5′－TGAGACAGATAGCTATYTAYGGHAA－3′）和CDHPnif723R（5′－GATGTTCGCGCGGCACGAADTRNATSA－3′），以及nifH2（5′－TGYGAYCCNAARGCNGA－3′）和 nifH1（5′－ADNGCCATCATYTCNCC－3′），进行巢氏PCR扩增，获得228条序列；以获得的序列加上当时GenBank中的219条序列，共447条序列，构建系统发育树，显示出一支独立于已知4个Cluster的深海簇（Deep branches）。

2009年，Dang等[14］用Mehta设计的固氮基因引物[12］对鄂霍次克海水合物区2个站位的沉积物样品进行扩增，克隆出的nifH基因多样性更加丰富，其中新分离出的ClusterⅤ是当时该地区特有的固氮基因簇。

2013年，Dang等[15］还是用同一对固氮基因引物，对中国南海从几百米到上千米深度不同的12个站位沉积物样品进行扩增，获得1110个不同的DNA序列，分别属于α－变形菌纲、β－变形菌纲、γ－变形菌纲、δ－变形菌纲、厚壁菌门、绿菌纲、拟杆菌门、疣微菌门和广古菌门，这些序列与已知序列的相似性为40.1%～100%。此次南海nifH扩增分出了9个大的Class，体现了固氮微生物更高的多样性[15］。

3 不同海洋生态环境的微生物固氮

微生物通过固氮为海洋提供了大量的新氮。2002年，估算的全球海洋氮固定能力为100～200Tg N·a－1，即每年100×1012～200×1012g N[16］。这些清洁氮源对维持海洋初级生产力具有重要意义。分子生态学研究发现，从表层海水到大洋深处沉积物，固氮微生物的类群分布具有一定规律，并不是杂乱随机的。真光层上部表层水体中分布的是自由生活或内共生的蓝细菌门和γ－变形菌纲；靠近表层出现的多是α－、β－、γ－、δ－变形菌纲和绿菌门；海洋水体深处中存在的一般是α－、γ－变形菌纲以及古菌；海草和盐沼生态系统中常为变形菌纲、厚壁菌门；沉积物中主要是变形菌纲，深海沉积物中还扩增得到众多古菌[17］。

3.1 深海的固氮微生物

目前已经发现海底的冷泉、热泉、火山口和水合物区都存在高密度的微生物。对这些地区固氮微生物的探索主要采用分子生物学方法。2005年开展的深海调查计划 Leg 201of the Ocean Drilling Program at Site 1230，在邻近水合物区的沉积物柱状样品中发现了由微生物群落支持的生态系统，分离出了可能的固氮微生物Rhizobia和Vibrio diazotrophicus[18］。

Mehta等[12］用固氮基因引物扩增位于太平洋东北部胡安德富卡洋中脊（Juan de Fuca Ridge）附近的Axial Volcano和Puffer两个受火山活动影响的热液喷口，得到约400bp长的固氮基因片段，从系统进化关系分析得出主要的nifH克隆分布在ClusterⅡ、ClusterⅢ和ClusterⅣ三个簇。这表明深海热液环境固氮基因具有多样性，又因为其独特的地理位置而具有特殊性。而所有来自深海样品的nifH基因都与嗜热的厌氧古菌Methanococcus thermolithotrophicus有77%～83%的一致性，表明深海热液喷口nifH基因有两个来源，一个是厌氧高温海床，另一个是冷的富氧深水[12］。

对深海水合物环境中的固氮微生物研究，将海底的氮循环、碳循环以及硫循环紧密联系在一起。水合物区的厌氧甲烷氧化古菌（Anaerobic methane oxidizing archaea，ANME）和硫还原细菌（Sulfate－reducing bacteria，SRB）之间广泛存在合作共生关系[19］。甲烷气体的温室作用比CO2更强，ANME和SRB的共生关系减少了甲烷气体从海洋向大气的释放，也正由于这种共生关系使得ANME至今不能纯培养，只能采用分子手段研究其生理生化特点[19］。浅表水合物支撑深海环境中生物群落和生产力，这种生态系统对氮源有大量需求。化学分析表明，硝酸盐和亚硝酸盐在深海热液喷口处浓度仅为40μmol·L－1，在高于30℃的还原性水体中更加缺乏，而氨在深海和冷泉的浓度小于1μmol·L－1，海洋中最大的氮源是氮气，在深海中浓度能达到0.59mmol·L－1[20］。微生物固氮能给碳源丰富、氮源缺乏的甲烷溢出环境提供氮源。深海Eel River Basin海盆固氮酶宏基因组研究发现，主要的固氮酶来自Deltaproteobacteria和Methanosarcina，随后直接标记检测证明ANME和SRB甲烷氧化共生体存在固氮能力，这一发现说明这两类微生物对深海水合物区新氮的输入具有重要作用，固氮是一个普遍现象，甲烷氧化联合体（Methane－oxidizing consortia）可能直接参与了氮固定[19］。从甲烷溢出环境分离到的甲烷氧化古菌（GenBank：AB362194）基因上含有一个固氮酶操纵子，支持了甲烷氧化联合体固氮假说[19］。目前的数据表明ANMEs被分成3种系统发育类型，其中 ANME－2、ANME－3与δ－变形菌纲的SRB微生物形成共生，ANME－1则单独进行甲烷氧化[21－25］。

Dang等[14］对鄂霍次克海水合物区沉积物固氮酶进行PCR扩增表明，这一地区有着独特的nifH 基因，并且大部分的序列来自于没有培养的和未知的细菌或古菌。用 PCoA（Principal coordinates analysis）分析热液喷口、深海甲烷溢出环境和海水的固氮微生物群落结构表明，表面海水、热液喷口附近、水合物区的固氮微生物是3个差异很大的群落，进一步表明环境特点强烈影响到固氮微生物的群落组成和结构。

3.2 近海的固氮微生物

微生物固氮的同时吸收CO2，因此固氮影响着海洋碳的输入输出。了解海洋固氮微生物对定性和定量预测固氮对碳循环和全球碳变化的影响十分重要[26］。地表径流以及大气沉降[27，28］携带各种物质进入海洋，包括高浓度的无机氮和各种微量元素等，再加之近岸海水较浅、有利于光合作用等因素，使得靠近大陆的海洋微生物丰度和多样性比深海或寡营养海域都更加丰富。对近海或者大陆边缘海的固氮研究，研究对象基本分为水体和沉积物，这是两种完全不同的固氮生态环境。海水中的氮固定以固氮蓝细菌为主导[27］，特别是单细胞固氮蓝细菌巨大固氮能力的发现[29，30］，改变了以Trichodesmium为主研究海洋水体固氮的格局。

近海和河口地区一般被看作是由反硝化作用造成的氮净损失区[31］，营养盐特别是铵盐丰富，对固氮有抑制作用[32］，因此有学者认为这些地区固氮作用不是十分重要。但是在海草生长区、珊瑚礁、红树林等海域，甚至是这些生态区外的沉积物固氮研究显示固氮作用是存在的[33］，如果忽略这些确实存在的固氮作用，那么就很难正确研究近海的氮平衡问题。

红树林、珊瑚礁和海草床等是近岸海洋生态功能区，也是固氮研究的热门区域。红树林能起到防风防浪的作用，是有重要防护作用的热带和亚热带海洋生态系统。我国沿岸的这些生态功能区基本处于不健康或者亚健康状态[34］。Zhang等[35］对我国三亚地区红树林生态系统中的固氮微生物采用不依赖于培养的PCR－DGGE（Denaturing gradient gel electrophoresis）技术进行研究，发现主要的固氮微生物类群为：Azotobacter、Desulfuromonas、Sphingomonas、Geobacter、Pseudomonas、Bradyrhizobium 和Derxia；CCA（Ca－nonical correspondence analysis）分析显示有机碳和钾是影响微生物群落分布的主要因素。Dias等[36］对巴西圣保罗州的两个红树林生态区（其中一个受石油开采影响、另一个不受影响）进行固氮基因nifH 的研究，发现这两个地区的nifH的丰度相当，但是物种分布不同，与石油污染的影响有关。Vovides等[37］对位于墨西哥南下加利福尼亚州的红树林生态系统进行调查，通过乙炔法测定保护区、重新种植区、自然生长区、遭受破坏区四种状态下的红树林生态系统中的淤泥微生物固氮作用，发现未受破坏的三种红树林生态系统之间的固氮差异不显著（39～47mg N·m－2·a－1），但与遭受破坏的红树林生态系统比较差异显著，是遭受破坏的红树林生态系统固氮能力的7～8倍；遭受破坏的红树林泥样中较高的盐度和pH值可能影响了微生物固氮作用，微生物固氮功能起到了指示红树林健康状况的作用。

4 固氮作用研究的新视角

一直以来人们总是从缓解海洋环境氮限制角度探讨微生物固氮作用，偏重于寡营养和远洋海域的固氮作用研究。近年来随着研究的深入，人们逐渐意识到固氮作用对近岸环境也具有重要的生态学意义，从新的视角开展了固氮研究。

4.1 固氮微生物对环境的指示作用

沉积物质量的改变必将影响栖居其中的微生物群落结构、多样性以及活性。例如红树林毁坏后，盐度和pH值升高使微生物固氮活力下降，固氮微生物起到了指示红树林健康状况的作用[37］。史氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）是广泛生活在人肠道中的产甲烷广古菌，环境再生长的可能性很低，拥有独特的nifH 基因，2011年，Johnston等[38］用该古菌的nifH基因指示水体污染，论证了这一方法的可行性。这些研究都提到了固氮微生物的环境指示作用，为固氮微生物研究提供了新思路。

4.2 富营养环境固氮微生物的研究意义

在人类活动影响氮循环之前，氮元素一直是生物生长的限制因素。化肥工业的出现和发展推动了农业生产的发展，却人为地加快了氮固定的速率，加速更多不可利用的无机氮转化成生物可利用的氨，人类对空气中氮的固定超过了地球自然固氮的总和[39］。过量使用化肥导致可溶解的氮营养盐随着雨水冲刷和陆地径流最终进入到海洋，必将打破原有的氮循环平衡状态。接踵而来的是受全球氮循环改变引起的一系列危机，例如：对海洋特别是近岸海域原有固氮作用和氮循环的相关微生物产生重要的影响，导致生物多样性发生变化；外源营养盐增多，导致生物固氮能力降低，同时对CO2的固定能力降低，最终使得气候变暖；氮盐输入经常引起水体富营养化，使得水质变差，威胁水生生物生长甚至死亡，这些后果都将造成人类生存危机[40］。也使得近岸富营养化海域的固氮微生物生态研究呈现出新的意义。

5 结语

固氮微生物和固氮基因在海洋环境中广泛存在，种类丰富。近年来人们应用新技术从多角度多方位对海洋固氮作用进行研究，发现固氮基因分布和环境因子具有相关性，对环境具有一定的指示意义，但是相关研究仍然欠缺。对近岸海洋固氮作用的研究揭示了近海固氮存在的一些区别于传统观念的现象，使得人们重新认识固氮微生物的生态作用，同时开辟了固氮基因分子生态学研究的新视角。

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