不同磷水平下丛枝菌根真菌（AMF）对狗牙根生长与再生的影响

叶少萍，曾秀华，辛国荣，白昌军，罗仁峰，刘新鲁

（1.有害生物控制与资源利用国家重点实验室 广东省热带亚热带植物资源重点实验室 中山大学生命科学学院，广东 广州510275；2.广州市园林科学研究所，广东 广州510170；3.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室，海南 儋州571737；4.常熟市山水园林景观艺术有限公司，江苏 常熟215500）

草坪是人们生存环境的重要组成部分，与人类的生产和生活密切相关，在净化空气、吸附粉尘、水土保持等诸多方面具有独特的功用。随着我国经济的迅速发展和人们生活质量的改善，草坪已经成为美化环境和休闲娱乐的重要场所之一。人们对草坪的需求日益增加，然而目前在草坪利用和管理上存在的不足之处也日益凸显，例如，一些运动场草坪的介质通常以沙为主，对养分的保持能力较低；人们在养护管理中容易过度施肥；大量灌溉用水极易引起养分的渗漏损失，最终引起一系列的环境问题，因此如何合理提高肥料利用率并有效减少肥料的使用量和减少水资源浪费在草坪管理中显得非常重要。此外，磷元素是植物生长发育的必需营养元素之一，主要参与和调节植株机体各种代谢活动。土壤的磷元素水平直接影响植物对磷的吸收，然而大部分土壤均普遍缺磷，并且所施用的磷肥利用率较低，这些因素在一定程度上增加了草坪草的管理成本和推广难度。基于此，研究发现施加生物肥料有利于减缓养分流失给草坪管理带来的管理压力［1］，其中菌根菌肥的施用已逐渐引起人们的关注。

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤中常见的真菌种类，与植物共生并在地下形成菌丝网，在改善植物生长、增强植物抗逆性等方面发挥着重要的作用，尤其是菌丝网的形成对于植物根系吸收和吸附养分、水分，提高养分利用率，防治养分流失具有重大的意义。大部分草坪草在不受干扰的自然环境中都能与AMF形成丛枝菌根共生体。一般认为，AMF定殖于草坪草根系，能够从草坪草体内获取生长所需的光合产物，反过来其庞大的菌丝体网络又能够促进草坪草对矿质营养的吸收，有利于提高草坪的根系深度、肥料利用、建植速度、对病害与干旱的抵抗能力以及防除杂草等［2］。研究表明，AMF可以提高草坪草对磷元素的利用率，例如菌根化红三叶草（Trifoliumpratense）植株磷含量明显增加［3］。目前，AMF与草坪草的共生关系在草坪草建植与管理中的应用潜力已逐渐引起人们的关注。

狗牙根（Cynodondactylon）为禾本科狗牙根属，是暖季型草坪草中应用最广泛、研究最深入的草种之一，目前在我国大部分地区均有种植并已得到大面积推广，当前已经在狗牙根野生种质资源收集、优良品种培育以及草茎播种、建植成坪等方面开展了深入探索［4，5］。本课题组前期研究发现，AMF菌剂如根内球囊霉（Glomusintraradices）与狗牙根根系能形成良好的共生关系，并能促进刈割后狗牙根再生生长［6］。但是，关于施磷量和接种不同AMF菌种对狗牙根植株磷、氮元素积累及再生的影响仍未见相关报道。因此，本研究采用盆栽试验，以狗牙根为宿主植物，在3个施磷水平下，通过接种摩西球囊霉（G.mosseae）和聚丛球囊霉（G.aggregatum）菌种，测定狗牙根地上部磷、氮浓度以及不同刈割时期的生长指标，研究接种AMF和施磷量对狗牙根生长和再生的影响，为AMF菌剂在狗牙根种植和刈割后养护等方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

试验选用2种AM菌剂：1）摩西球囊霉（以下简称Gm）编号为BGC HUN01A，分离自湖南湘潭大学（E 112.86°，N 27.88°），宿主是杉树（Cunninghamialanceolata）；2）聚丛球囊霉（以下简称 Ga）菌株编号为 BGC HUN02D，分离地是湖南桂阳（E 112.72°，N 25.73°），宿主为狗牙根。菌剂为含有感染根段、孢子丰富的土壤细沙混合物，由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 试验地条件 盆栽试验在广州中山大学测试大楼天台大棚进行，试验期间大棚内温度为20～42℃，光照平均时间为13～14h。供试土壤采自华南农业大学增城实验基地，土壤pH 5.11，有机质6.88g/kg，全氮1.18 mg/g，速效氮43.66mg/kg，全磷51.80mg/kg，速效磷9.43mg/kg。采集的土壤经风干，过2mm网筛后，以沙土1∶3的比例混匀，在105℃下湿热灭菌2h。盆栽花盆高度10cm，直径15cm，装土前在花盆内套上塑料袋，以防止水肥流失。每盆装入1kg土壤，同时施入尿素（N2HCONH2）和硫酸钾（K2SO4）作为基肥，使纯N、K2O含量分别为200，250mg/盆。2009年6月7日追肥1次，每盆施加200mg N和250mg K2O。

1.2.2 试验设计 试验设3个施磷水平，施入磷肥－水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O），使速效磷含量w（纯P）依次为20，40，100mg/kg，标记为P20、P40、P100；同一施磷水平设接种Ga、Gm、Ga/Gm（比例1∶1）和不接种菌剂（以下简称NG）4个处理，接种量12g/盆（1g菌剂约含75个孢子）。试验共12个处理，每个处理3次重复。

2009年4月14日播种巴拿马狗牙根（C.dactyloncv.Banama，bermudagrass），播种量为200mg/盆（百绿国际草业有限公司，2006）。花盆随机摆放，期间每天浇水一次保持湿润。狗牙根4月17日出芽，5月5日进入分蘖期。5月27日、6月11日、6月26日分别测量狗牙根生长高度，然后刈割狗牙根，留茬高度为2.5cm；7月23日收获狗牙根植物样，其中地下部分保存在4℃冰箱中用于测定菌根侵染率。

1.2.3 测定项目 每次刈割后，取一定量狗牙根地上部鲜样，经105℃杀青30min、70℃烘干至恒重，测定地上部干重；地上部用硫酸－双氧水消煮法消解后，用凯氏定氮法测定氮，用钼蓝比色法测定磷［7］；取1cm长的新鲜根段用曲利本蓝（Trypan Blue）染色法染色［8］，制作切片，然后在光学显微镜下采用网格交叉计数法统计菌根侵染率［9］。

1.2.4 数据处理与分析 试验数据用SPSS 16.0统计软件计算平均值，并进行方差分析和LSD检验（P＜0.05）；图形绘制采用Excel 2003。

表1 接种不同菌种对狗牙根菌根侵染率、地上部N和P浓度的影响Table 1 Effect of different AMF species on mycorrhizal infection rate，above－ground N and P concentrations of bermudagrass

2 结果与分析

2.1 狗牙根的菌根感染特征

不接种菌种的狗牙根根系未发现菌根侵染（表1）。从接种菌种方式来看，狗牙根根系菌根侵染率在单一接种Ga、Gm处理中分别为58.01%和49.50%，在混合接种处理中则为42.88%，各处理间差异显著。此外，不同施磷水平对菌根侵染的影响存在差异，菌根侵染率P40处理最高，P20处理次之，最低是P100处理（表2）。

表2 施P水平对狗牙根菌根侵染率、地上部N和P浓度的影响Table 2 Effect of P levels on mycorrhizal infection rate，above－ground N and P concentrations of bermudagrass

2.2 菌根化狗牙根地上部N、P浓度

植株N、P浓度能够反映植物对土壤N、P元素的吸收和利用状况。一方面，接种不同菌种对狗牙根地上部N、P浓度的影响不同。与不接种处理相比，菌根化狗牙根N、P浓度在单一接种Ga或Gm处理中有所增加，而在混合接种处理中则分别下降了7.10%和6.42%（表1）。另一方面，随着施磷水平的提高，狗牙根地上部N、P浓度呈现“先升后降”的趋势，在P40处理下浓度最高，而P100水平对N、P浓度表现出了抑制效应（表2）。

2.3 接种菌根真菌和施磷对狗牙根刈割后再生能力的影响

2.3.1 狗牙根地上部干重 4次刈割时，接种菌种处理下狗牙根地上部干重均高于不接种处理，方差分析结果显示在第2、4次刈割时各处理间差异达显著水平（表3）。从菌种接种方式来看，单一和混合接种对不同刈割时期地上部干重的影响不同，第1、4次刈割时单一接种Ga或Gm的地上部干重高于混合接种，在第2、3次刈割时则是混合接种高于单一接种。总的来看，狗牙根地上部总干重呈现出Ga＞Gm＞Ga/Gm＞NG的趋势，且接种与不接种处理之间差异显著，表明菌根化狗牙根的刈割后再生能力较非菌根化处理已明显增强。

表3 接种不同菌种对狗牙根地上部干重的影响Table 3 Effect of different AMF species on above－ground dry weights of bermudagrass g/盆Pot

此外，施磷水平对狗牙根地上部干重有显著影响，第1次刈割时呈现出P40＞P20＞P100的趋势，在第2，3，4次刈割时则是P40＞P100＞P20，尤其是在第1，2，3次刈割时各处理间差异显著（表4）。总体上，P40水平下总干重积累量最大，分别比P20、P100水平显著高出14.3%和12.3%，表明土壤施磷量40mg/kg有利于狗牙根表现出极佳的刈割后再生能力。

2.3.2 狗牙根的再生速度 试验对狗牙根共进行4次刈割，结果显示刈割后狗牙根再生生长良好（表5和6）。随着刈割的进行，狗牙根再生速度表现出明显的“先快后慢”的趋势，至第3次刈割时各处理再生速度均达到最大值，至第4次刈割时则再生生长变得缓慢，再生速度均显著降低至0.90cm/d以下。

表4 施P水平对狗牙根地上部干重的影响Table 4 Effect of P levels on above－ground dry weights of bermudagrass g/盆 Pot

与不接种菌种处理相比，除了第1次刈割的混合接种处理和第2次刈割的单一接种Ga处理之外，接种菌种在不同程度上提高了狗牙根刈割后的再生速度，且在第3、4次刈割时增幅显著达到15.7%～25.45%（表5）。

第1，2，4次刈割时，不同施磷水平之间狗牙根再生速度差异达显著水平，表现为P40＞P100＞P20；第3次刈割时则是P40＞P20＞P100，但差异不显著（表6）。总体上，土壤施磷量40mg/kg比20或100mg/kg更能加快狗牙根刈割后的再生生长。

2.4 接种菌根真菌和施磷的交互效应对狗牙根的菌根感染、刈割后再生的影响

施磷水平和接种不同菌种相互作用条件下，除了对地上部全P和全N含量无显著影响外，对其他指标都影响显著（表7和8）。例如，在P40水平下单一接种Ga或Gm，可显著增加狗牙根的菌根侵染率以及刈割后的再生速度和地上部干重的积累。

此外，对不同处理下狗牙根地上部氮、磷浓度进行相关性分析发现，氮、磷浓度呈极显著正相关（r＝0.956，n＝12，P＜0.001）（图1）。

表5 接种不同菌种对狗牙根再生速度的影响Table 5 Effect of different AMF species on regrowth rates of bermudagrass

表6 施P水平对狗牙根再生速度的影响Table 6 Effect of P levels on regrowth rates of bermudagrass

表7 施P水平×接种不同菌种的相互作用对狗牙根根系菌根侵染率、地上部N和P浓度的影响Table 7 Combined effect of different AMF species and P levels on mycorrhizal infection rate，above－ground N and P concentrations of bermudagrass

3 讨论

在自然条件下，植物与AMF的共生现象比较普遍，但不同的植物对菌根的依赖关系差异很大［10］。Hartnett和Wilson［11］认为，与C3植物相比，C4植物根系AMF侵染率更高，对菌根的依赖性更强。本试验选用的狗牙根为C4型多年生草本植物，结果显示其根系能与摩西球囊霉和地表球囊霉菌剂形成良好的共生关系，表明狗牙根也是菌根依赖型植物，这与曾秀华等［12］观察的试验结果一致。当然，狗牙根对不同的AMF响应不同，表现为地表球囊霉对狗牙根较摩西球囊霉更具亲和力、侵染率更高，这可能与地表球囊霉菌剂分离自宿主狗牙根根际有关。同时，从接种方式来看，单一接种比混合接种的侵染率高，分析其原因可能是混合菌剂间可能存在拮抗作用从而使侵染效果减弱。

由于丛枝菌根可增加植物根部的吸收面积，促进植物根系对矿物元素及水分的吸收［13］，因此能够改善宿主植物的生长。然而，国内外关于草坪草的研究多集中在营养吸收、抗逆性、病害控制以及品质改良等方面，而关于菌根真菌对其生长方面的作用机制研究则相对较少。研究发现，草坪草的生长与菌根真菌的侵染有着密切的联系，根系粗糙的暖季型草坪草，例如狗牙根对AMF的依赖性很强［14］，而根系较好的冷季型草坪草，如剪股颖（Agrostisstolonifera）也能形成大量的菌根结构并从中获益，尤其是在P含量较低的土壤中［15，16］。AMF能够改善草坪草的生长主要是通过促进宿主植物对土壤营养元素的吸收和积累来实现的，例如，菌根化的草地早熟禾（Poapratensis）［17］、多年生黑麦草（Loliumperenne）［18］植株氮、磷含量均显著高于非菌根化植株，本研究在单一接种摩西球囊霉或地表球囊霉处理的狗牙根中也观察到类似的结果。谭继清［19］将AMF菌肥使用在草坪播种或接种于表土，可提高N、P、K等肥效，对促进草坪前期生长和降低养护管理费用都有良好的效果。一方面，AMF能够促进植物吸收氮、磷等元素，这与氮、磷相关代谢酶活性的增强有关。例如，AMF侵染植物后，能够增强植物根系分泌的酸性或碱性磷酸酶以及溶磷细菌的活性，同时AMF菌丝也能分泌酸性或碱性磷酸酶，从而活化土壤有机磷，将其转化为植物可利用的无机磷，增加寄主对土壤有机磷的利用［20］。苏友波等［21］对玉米（Zeamays）接种AMF，结果显示接种AMF对根际土壤酸性和碱性磷酸酶活性均有增强作用。而氮素的转化主要受脲酶、硝酸还原酶等影响，AMF可增强相关酶活性从而促进宿主植物对氮素的利用［22］。另一方面，植株吸P量的增加可能也有利于增加对N的吸收。石伟琦等［23］发现接种AMF对羊草（Leymuschinensis）的N、P含量产生了不同的效果，接种对含N量的影响比对含P量的影响更加明显，这可能是由于P能促进植物更多地利用NO3－N，即“以磷促氮”效应。本试验中，狗牙根地上部氮、磷素积累的协同效应明显，可能也暗示着存在“以磷促氮”效应。总的来看，AMF能够改善植物对氮、磷的吸收和利用状况，间接的有利于减少土壤中氮、磷的流失。本试验还观察到接种混合菌剂降低了狗牙根氮、磷含量，推测可能是混合菌剂

间的拮抗效应对植株氮、磷的积累存在抑制作用，应通过试验进一步探讨其中的机制。

表8 施P水平×接种不同菌种相互作用对不同时期狗牙根地上部干重、再生速度的影响Table 8 Combined effect of different AMF species and P levels on above－ground dry weights and regrowth rates of bermudagrass

图1 狗牙根地上部N、P浓度之间的相关性分析Fig.1 Correlation analysis between above－ground N and P concentrations of bermudagrass

刈割是草坪草养护管理的常见方式，研究发现刈割后草坪草根系菌根侵染率可能增加［24］或下降［25］，然而，关于AMF对草坪草刈割后再生生长的研究相对较少。本研究通过测定刈割后狗牙根地上部分生物量和再生速度来评价接种菌根真菌对狗牙根再生能力的影响。一方面，接种AMF菌剂能增加刈割后狗牙根地上部分生物量，并能提高其再生速度，表明菌根化狗牙根刈割后再生能力较非菌根化处理明显增强。同样，Wu等［6］发现刈割后菌根化狗牙根根系菌根侵染率增加显著，且地上部干重、叶片叶绿素含量也明显增加，因此推断AMF促进狗牙根的再生生长可能是通过改善植物光合作用而实现。分析本试验结果可能与菌根侵染使狗牙根营养吸收状况以及生长代谢活动得到改善有关。另一方面，单一菌剂对狗牙根再生生长的效果总体上优于混合菌剂，这可能与单一菌剂在狗牙根中具有更高的菌根侵染率有关。此外，随着刈割的进行，狗牙根再生速度表现出明显的“先快后慢”的趋势，在生长后期速度明显下降，表明刈割频率也是影响狗牙根再生生长的重要因素之一，在养护管理中应把握好刈割的时间间隔。

土壤磷水平是影响植物生长的重要因素之一［26］，在草坪草日常管理中应及时并适量施肥以确保植物生长最佳。普遍认为，AMF侵染宿主与土壤磷水平有着密切的联系，磷含量过低或过高均不利于菌根侵染［27］，例如在低磷或高磷浓度土壤中，接种AMF对玉米营养无贡献［28］。前人研究［29］指出在低磷土壤中适度增施磷肥可显著促进AMF发挥效应，因此适量施肥也能确保菌根菌剂在草坪草种植中的推广应用。本试验中土壤施磷量40 mg/kg时菌根侵染率、地上部氮和磷浓度最高，且刈割后再生生长也最快，表明狗牙根生长最适磷水平应为中等磷水平。同时，所选菌剂在3个磷水平下均能较好地侵染狗牙根根系，虽然在低磷或高磷水平下侵染率略有下降，但仍表现出一定的耐磷性。此外，本试验的结果还显示接种AMF菌剂和施磷水平之间存在显著的交互效应，可显著影响菌根侵染率和刈割后的再生能力。推测这种交互效应能够在一定程度上改善狗牙根的生长状况，从而有利于增强狗牙根对各种胁迫环境的适应能力，如在抗旱试验中，这种交互效应能够显著影响狗牙根的菌根侵染率、可溶性糖含量和过氧化氢酶活性等指标，从而在一定程度上改善狗牙根抵抗干旱胁迫的能力［12］，不过这种交互效应与狗牙根生长、抗逆性之间的作用机制仍需要进一步的深入研究。

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