骨移植的免疫学基础

韩耀坤,杜文彦

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

近年来,随着骨移植技术的发展,移植排斥反应越来越引起人们的重视。基础医学和临床医学都在不断地进行骨移植的免疫学方面的研究,尤其是同种异体骨移植和异种骨移植。本文主要就同种异体骨移植的免疫学基础问题进行讨论。学术界认为,异体骨移植引起的免疫反应以活性淋巴细胞和细胞毒抗体的产生为特征,其免疫原主要是细胞膜表面的糖蛋白。

1 骨与软骨的免疫原性

免疫是机体的免疫系统识别“自己”与“非己”成分并排斥异构物质的生理功能。免疫系统在免疫功能正常的条件下,对“非己”抗原产生排异效应,以保护机体免受抗原异物的侵袭。自体骨移植物与异体骨移植物之间唯一的区别就是前者是自己器官的组成部分而后者不是。这也就意味着异体骨会被排斥而自体骨和人工骨不会。在第二次移植入同一供者的骨移植物时,由于受者已被前次移植物上的抗原致敏,从而出现排斥反应加速的现象,也就是所谓的二次移植排斥反应。异体骨移植的二次排斥反应说明异体骨具有免疫原性。

抗原(antigen,Ag)是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答,并能与相应免疫应答产物在体内外发生特异性结合的物质。一个完整的抗原应包括两方面的免疫性能,一是免疫原性 (immunogenicity),指诱导宿主产生免疫应答的能力,包括诱导产生抗体及效应 T淋巴细胞,它必须经过抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)的加工、处理和呈递作用,才能被 T和 B淋巴细胞的抗原识别受体所识别;骨中抗原多为胸腺依赖性抗原,需 T淋巴细胞辅助才能刺激机体产生抗体,引起回忆应答,其刺激机体所产生的抗体多为 IgG,它们还可刺激机体产生细胞免疫。二是免疫反应性(immunorectivity),指抗原与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力,亦称为反应原性。免疫原性是抗原最重要的性质,抗原物质是否具有免疫原性,一方面取决于抗原本身的性质,另一方面取决于机体对抗原刺激的反应性。

正常成熟机体的免疫系统能够区别宿主自身物质与非自身物质,对自身物质一般不产生免疫应答,只对非自身物质产生免疫应答。这种化学结构与宿主自身成分相异或机体的免疫细胞从未接触过的物质称为异物,异物性是抗原物质的首要性质。不同物质之间的免疫原性差别取决于它们化学上的异质性 ,这是免疫识别的物质基础。一般,物质来源的亲缘关系越远 ,其化学结构差别越大,免疫原性也就越强;而亲缘关系越近,免疫原性越弱。因此,异种骨移植物排斥强烈,不能存活;同种骨移植物排斥较弱,可存活一定期限;而自体骨移植物不排斥,可长期存活。

骨组织由矿物质、胶原、非胶原蛋白和细胞成分构成。对于一块完整的新鲜骨而言,骨髓因富含造血细胞、内皮细胞、树突细胞等多种细胞成分,其免疫原性最强。有研究发现,去髓对同种异体骨的致敏作用没有明显影响,因而骨细胞本身也具有免疫原性。另外,移植骨中残存血液成分的血型抗原以及骨胶原基质和非胶原蛋白也能引起免疫反应,只是骨胶原基质和非胶原蛋白在不同个体间的差异很小因而其免疫原性很弱。骨骼中的矿物质不具有免疫性。总的来说,骨是一种复合组织,除骨组织本身的细胞成分和骨基质胶原外,还包括神经组织、脂肪组织、小血管和血液成分以及纤维结缔组织等,所有这些成分表面都具有遗传基因控制的特异性抗原,这些抗原均会引起同种异体或异种骨移植后的免疫排斥反应。

软骨组织由软骨细胞和周围致密的蛋白多糖和 II型胶原基质构成。游离的软骨细胞具有免疫原性,能够刺激宿主产生免疫反应,但当软骨面完整无缺时,由于软骨细胞周围致密的基质形成屏障,没有软骨细胞暴露,此时软骨细胞处于免疫特免状态,加上软骨组织无血管和淋巴管,缺乏血细胞及内皮细胞,因而不会引起明显的排斥反应。存在于基质中的蛋白多糖和连接蛋白可以游离到滑液中,沉积在滑膜上,并能诱发宿主产生特异性抗体和细胞免疫,但其免疫原性很低,仅能引起轻微的反应。因而带部分软骨基质的软骨细胞免疫原性比游离的软骨细胞弱,完整的关节软骨比软骨薄片免疫原性弱,软骨基质对软骨细胞具有保护作用。

2 骨组织的主要组织相容性复合体

在定义 T淋巴细胞和 B淋巴细胞之前人们就已经对免疫系统识别同种抗原有了了解。异体骨和其他异体组织和器官一样具有免疫原性。Muscolo@等的实验证明,主要组织相容性复合体(M HC)位点不同的大鼠间的交换植骨能诱导受体动物产生体液和细胞免疫,而 M HC位点相同的同系移植(供、受者遗传基因型完全相同或者基本相似)则不产生免疫反应。Friedlaender等[1]从接受冻干同种异体骨移植的病人体内检测到抗人类白细胞抗原(HLA)的抗体。Halloran等也证实,小鼠在接受同种异体骨移植后可产生针对 M HC产物的抗体。还有大量其他研究也同样表明,移植物上被识别的抗原是 M HC(在人类亦称 HLA)在细胞表面表达的产物。这些 M HC抗原被分为两类 ,I类和 II类。

M HC-I类抗原在人体内分布广泛,存在于所有的有核细胞膜上,即在骨细胞、成骨细胞及破骨细胞等细胞表面均表达,但在骨组织的含量较其他组织少。它由两种非共价结合的糖蛋白组成:重链(相对分子质量为44000)和 β 2微球蛋白(相对分子质量为1200)。轻链(β 2微球蛋白)在所有的 I类抗原中都是一样的。而重链则表现出高度的多态性,在人类,它由基因 HLA-A、HLA-B和 HLA-C编码。在移植排斥中,I类抗原是细胞毒性 T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL)识别的目标抗原,能诱导细胞毒抗体的生成及细胞毒性 T细胞反应,是引起移植排斥反应的主要因素。

M HC-II类抗原主要在 B淋巴细胞和其他的辅助细胞(如树突细胞)表面表达,并能在其他类型的细胞中诱导产生,如巨噬细胞、上皮细胞和血管内皮细胞。它由两种非共价结合的糖蛋白组成:α链(相对分子质量为32000)和 β链 (相对分子质量为28000)。M HC-II类抗原包括鼠的 I-A、I-E和人类 HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP抗原,它们由辅助性 T细胞(T helper lymphocyte,Th)识别,是 T细胞活化的必需信号,与机体免疫反应的发生和调节有密切的关系。M HC-II类抗原的组织分布有种属差异性,在骨组织中的分布不清楚。骨髓中含有造血细胞系、内皮细胞、树突细胞、巨噬细胞等多种细胞成分,它们多有 II类抗原的表达。Skjod等证实成骨细胞亦有 II类抗原表达。

M HC的高度多态性使无关个体间的 M HC型别不会完全相同,因而对异体组织有不同程度的排斥反应。除主要组织相容性抗原外,细胞表面还存在次要组织相容性抗原,如血型物质、组织特异性抗原、同工酶及 Y染色体伴性抗原等,它们在异体骨移植免疫中的作用尚不明确。

软骨细胞仅表达 M HC-I类抗原,不表达 M HC-II类抗原,软骨组织移植后,由于淋巴细胞释放的细胞因子,如IN F-γ等可发挥诱导作用 ,使软骨细胞获得 M HC-II类抗原的表达,这种表达将增强软骨移植物的排斥。软骨细胞表面的 M HC抗原在某些条件下可致敏淋巴细胞,引起免疫反应。

3 白细胞分化抗原

白细胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)是不同谱系白细胞系在正常或受刺激后分化和成熟过程中的某个阶段出现或消失的细胞表面标志物,是白细胞膜上的抗原或识别抗原的抗体。CD具有重要的生物学意义,参与识别抗原、捕捉抗原、促进免疫细胞与抗原或免疫分子间的相互作用,介导免疫细胞间、免疫细胞与基质间的粘附作用,在免疫应答的识别、活化及效应阶段均发挥重要作用。

T细胞受体(T cell receptor,TCR)和 CD3均为 T细胞膜上的重要分化抗原,是成熟 T细胞的特征性标志。由 α β异源二聚体组成的 TCR,通过编码α链和β链的基因片段的重排,构成具有不同特异性的分子,从而可对各种不同的抗原产生特异性应答。CD3至少由 γ、δ、ε、ζ、η五种多肽链组成 ,γ ε、δ ε、ζ ζ呈二聚体状态。CD3分子能与 TCR α β 非 共价结合 ,共同完成对抗原呈递细胞表面 M HC分子-抗原肽复合物的识别及活化信号传递。由γ δ异源二聚体组成的 TCR只在约5%的 T细胞表面表达,它的功能还不是太清楚,可能较TCR α β具有更丰富的连接多样性。T细胞表面的一些结构对TCR与外源性抗原的结合特异性无关,但能通过与靶细胞M HC分子决定簇的连接而很大程度提高细胞与细胞间的相互作用。

CD4为细胞膜表面单链糖蛋白,分布于部分 T淋巴细胞(Th表达 CD4分化抗原)和胸腺细胞表面,也发现于某些 B淋巴细胞和单核吞噬细胞上。CD4阳性 T细胞可识别异体或自身 MHC-II类分子-抗原肽复合物,有助于稳定 TCR与M HC-II类分子-抗原肽复合物间的相互作用。另外,CD4分子胞质区与蛋白酪氨酸激酶 P56lck相联,对 T细胞信号的转导起重要作用。

CD8是由α、β两条多肽链组成的穿膜糖蛋白,分布于部分 T淋巴细胞(CTL表达 CD8分化抗原 )、胸腺细胞和 N K细胞。CD8分子与 M HC-I类分子结合可以稳定 CTL与带有M HC-I类分子与抗原复合物的靶细胞结合,介导细胞间粘附作用。目前发现 CD8也与蛋白酪氨酸激酶 P56lck相关,在T细胞增殖和分化的信号转导中起重要作用。

Stevenson等[2]通过对狗同种异体近端桡骨移植免疫的研究发现,白细胞分化抗原不匹配的新鲜骨移植能刺激受者产生抗供者细胞表面抗原的抗体,这些抗体显著而持久地存在,并且可检测到抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC);而CD匹配的骨移植物则没有可检测到的抗体也没有发现ADCC。

4 免疫学因素对异体骨愈合的影响

异体骨移植不仅要保持肢体骨骼的连续性,而且更主要的是要保持骨的生物学特性,使异体骨成活。Burchardt认为,异体骨移植与宿主的愈合主要受移植骨抗原性影响,目前常用的处理方法均不能完全破坏异体骨的抗原,术后发生宿主与供体的免疫反应是难以避免的。免疫反应使异体骨周围炎症细胞浸润、再生血管变性和闭塞,造成骨诱导和骨传导作用减弱及广泛的骨吸收,引起骨延迟愈合、不愈合甚至骨折。新鲜自体骨与宿主骨的愈合最优,同种异体骨移植于宿主骨愈合的优劣次序为:冻干骨＞冷冻骨＞脱矿骨＞冷冻+照射骨＞冻干+照射骨＞新鲜骨＞脱蛋白骨。实验证明,M HC相匹配,有利于骨愈合,提高骨的生物力学特性。1996年,Stevenson等[3]发现 M HC不匹配能激发特异性免疫反应,这种抗移植物的特异性免疫反应在带血管的新鲜同种异体骨移植中1周内即可见到,在不带血管的新鲜同种异体骨移植中3周内能见到,但在冷冻处理的同种异体骨中,则是瞬时的、少见的。Burchardt根据动物同种异体腓骨移植实验得出以下结论:若供、受者 M HC抗原差异很小或没有差异,移植骨与宿主的愈合过程与自体骨移植相似,没有疲劳骨折,移植16周后移植骨与宿主骨连接,移植骨的成骨量、塑性形均与自体骨移植接近;若供、受者 M HC抗原差异较大,则愈合过程缓慢,较多发生不连接或延迟连接,可表现为移植骨周边被吸收或移植骨体积变小,移植骨内部被吸收范围扩大,延伸至间质板层,移植骨机械强度明显下降;若供、受者存在着强烈的 M HC抗原差异,则没有修复征象,移植骨迅速被吸收。可见,在动物体内移植骨的免疫原性与其生物愈合是成反比的。在异体骨移植中,骨松质的愈合是通过在坏死的骨小梁上直接形成新骨,骨小梁间的肉芽组织会阻碍成骨作用,Stevenson等发现,骨移植物的免疫性与骨小梁间纤维结缔组织的量成正比,由此可见,免疫反应对骨松质的愈合是不利的。

Muscole[4]等按骨肿瘤协会评分系统对46例接受冷冻同种异体骨移植的患者进行疗效评价,发现组织学上表现出免疫反应者得分明显降低,接受部分 HLA-I类抗原匹配的移植物其得分高于完全不匹配者。Friedlaender@等发现,接受大块冷冻同种异体骨移植的患者,其远期疗效与 HLA-II类抗原的匹配程度有关,HLA-II类抗原的匹配有利于提高同种异体骨移植的远期疗效。上述研究均显示,对人类而言,M HC的差异对同种异体骨移植的愈合由影响但不似动物体内那么明显。有学者发现,抗体滴度与移植骨的愈合无显著的相关性,认为循环抗体对移植骨没有危害,移植骨被宿主替代过程中抗原物质的缓慢释放对宿主起了脱敏作用,使宿主发生免疫耐受。也有人认为,异体骨移植早期有淋巴细胞浸润,新骨形成可将残存异体骨包裹,避免免疫原与宿主的免疫活性细胞接触诱发免疫反应。1975年,Laner证实异体骨移植的免疫反应过程中 B细胞会产生一种名为封闭因子(blocking factor)等抗体,这种抗体可以阻止免疫反应进一步扩大。

5 骨移植排斥的防治

由于 M HC具有高度多态性,同种骨移植后的免疫排斥反应一般都无法避免。减轻同种异体骨移植排斥反应的方法主要有以下几种:

(1)组织配型:很显然,如果骨移植物的 M HC与宿主能很好地匹配,免疫排斥反应便不会发生。采用组织配型可以最大限度地减少供、受者间的组织不相容性,从而提高同种异体骨移植的成功率,但是由于人类的 HLA的高度多态性,除同卵孪生外,不可能达到完全的组织配型,因而组织配型的目的只是选择合适的供体,使其与宿主之间有尽可能多的共同抗原。这项工作的开展必须以骨库的建立为先决条件,首先进行供体和宿主之间的交叉配血试验,阴性者再进一步做血清配型和混合淋巴细胞培养,比较供体和宿主的共同抗原。

(2)对宿主的免疫抑制:免疫抑制药的应用是临床上疗效最为确切的防治移植排斥反应的方法,通过人为将宿主的免疫功能降低到适当水平,从而克服宿主和移植物之间的排斥反应,其缺点是免疫抑制是非特异性的,是针对所有抗原刺激的,若免疫功能过低,容易合并感染和其他疾病。常用的免疫抑制药物有如下几种。

1)化学类免疫抑制剂:包括肾上腺糖皮质激素、环孢素A(cyclosporinA,CsA)、环磷酰 胺 (cyclophosphamide,Cy)、硫唑嘌呤 (azathioprine,AZT)、大环内酯类抗生素 FK506(prograf)、霉酚酸酯 (mycophenolate mofetil,MM F)等。

糖皮质激素是临床上最常用的免疫抑制药,其种类很多,最常用的是泼尼松 (prednisone,Pred)、泼尼松龙(prednisolone)、氢化可的松 (hydrocortisone)和甲泼尼龙(methylprednisolone,M P).在宿主接受抗原刺激之前使用糖皮质激素能较为有效地抑制免疫排斥反应,可能是由于皮质激素能抑制白细胞游走,IL-1及其他淋巴因子的产生。

Cy在细胞增殖期和分化期的作用最强,作用于细胞分裂周期的 G2期,因而分裂速度快的 B细胞比 T细胞对 Cy更敏感。它对体液免疫抑制作用较强,能抑制抗体的形成,也可以抑制细胞免疫。

AZT可以抑制嘌呤合成 ,杀死有丝分裂期的细胞,阻滞S晚期或 G2早期的发展,减低细胞增殖速度,在宿主受抗原刺激后运用较好,其抑制细胞免疫比抑制体液免疫的作用强,抑制 T细胞免疫比抑制 B细胞强。无论细胞免疫还是体液免疫,AZT只能在免疫应答的早期起抑制作用,过早或过晚均无效。M TX能阻止淋巴细胞增殖,抑制宿主产生特异性抗体。

CsA是目前主要的免疫抑制药,它能抑制 IL-1和 IL-2的产生,抑制淋巴细胞 IL-2受体的表达,从而抑制 CTL的生成、增殖和分化,抑制免疫排斥反应。

FK506的作用机制与 CsA的类似,其主要作用是抑制Th释放 IL-2和抑制 CTL的增加以及细胞介导和体液免疫应答对移植抗原的反应,其抑制活性是 CsA的100倍。

随着新型免疫抑制剂相继问世,免疫抑制剂组合方案也正在出现新的格局和变化,如 FK506+Pred+MM F联合应用。新型免疫抑制剂 FTY-720可改变淋巴细胞的归宿,改变抗黏附分子(ICAM-1)的合成及表达,可能通过改变 Bcl-2/Bax的比值诱导淋巴细胞凋亡。FTY-720与多种免疫抑制剂如 CsA有良好的协同作用,有很高的生物利用度,且药物毒性反应小。

2)生物制剂:主要是某些抗免疫细胞膜抗原的抗体,如淋巴细胞球蛋白(ALG),抗胸腺细胞球蛋白(ATG),抗 CD3,抗 CD4和抗 CD8单克隆抗体,抗 TCR单克隆抗体,抗 ICAM-1抗体等。这些抗体通过与相应膜抗原结合,借助补体依赖的细胞毒作用,分别清楚体内的 T细胞或胸腺细胞。

3)中草药类免疫抑制剂:某些中草药具有明显的免疫调节或免疫抑制作用,如雷公藤、冬虫夏草等。雷公藤多苷是雷公藤根生药的水-氯仿提取物,它保留了雷公藤的免疫抑制作用,去除了某些毒性成分。雷公藤多苷能抑制 IL-2的分泌,抑制 T淋巴细胞增殖早期 IL-2受体的表达。

移植前进行血浆置换,可除去受者血液内预存的特异性抗体,以防止超急性排斥反应。临床上还应用脾切除,放射线照射骨移植物或受者淋巴结等技术来防治排斥反应。

(3)移植骨抗原处理:由于同种异体骨移植物可以没有存活细胞,因此可以采用多种方法,尽量去除或杀死骨移植物内的细胞成分,以减弱其抗原性。尽量彻底刮除移植骨的骨髓、骨膜,反复洗涤,是简单有效的去除抗原方法,但机械方法不可能完全去除移植骨的细胞成分。目前多采用煮沸、射线辐照、冷冻、高温煅烧、脱蛋白处理来降低骨移植物的免疫原性以减弱排斥反应。脱钙、冷冻和冻干都过于温和,不足以消除异种骨的抗原性;煮沸、煅烧、大剂量射线辐照和化学脱蛋白又太剧烈,破坏了移植骨内有益的生物活性物质[5]。

综上所述,骨移植的免疫学研究还处于不断完善的阶段。到目前为止,还没有一种十分理想的方法能够既保存异体骨的生物活性又能消除其抗原性。这需要学术界不断进行研究和完善。随着干细胞技术和基因技术的发展,人类一定能够攻克这一难题。

[1]Friedlaender GE,Strong DM,Tomford WW.Long-term followup of patients with osteochondral allografts:a correlation between immunologic responses and clinical outcome[J].Orthopedic Clinics of North America,1999,30(4):583-588

[2]Stevenson,Li XQ,Martin.The fate of cancellous and cortical bone after transplantation of fresh and frozen tissue-antigen-matched and mismatched osteochondral allog rafts in dogs[J].J Bone Joint Surg(Am),1991,73:1143-1156

[3]Stevenson S,Shaffer IW,Goldberg VW.The humoral response to vascular and nonvascular allografts of bone[J].Clin Orthop,1996,(326):86-95

[4]Muscolo MD,Ayerza MD,redal PhD.Human leukocyte antig en matching,radiographic score,and histologic findings in massiv e frozen bone allog rafts[J].Clin Orthop,1996,326:115-126

[5]徐印坎,葛宝丰,胥少汀.实用骨科学 [M].北京:人民卫生出版社,2008,1897-1899