1株野生大型食用菌的分子鉴定与同源性分析

雷 琼，汪 俭，范晓丹，章 俊，马立安 （长江大学生命科学学院，湖北荆州434025）

世界食用菌资源非常丰富，目前有1500～2000种，其中已经确认的有981种［1］，大约还有1／2的尚未鉴定。传统食用菌的分类及鉴定主要是基于菌丝、孢子和子实体的形态学特征并结合其生理生化性状的描述，但由于真菌形态特征易受到培养条件和其他因素的影响，许多子实体类型经常难以获得，因而传统的分类方法已无法满足一些未知品种的分类及鉴定要求。

真菌核糖体基因转录间隔区 （internal transcribed spacer，简称ITS），又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA上18s和28s基因之间的区域片段，其两侧分别是18sRNA基因和28sRNA基因，其长度一般为650～750bp；White等［2－3］于1990设计了ITS1、ITS4、ITS53对引物可用于大多数担子菌和子囊菌的特异性鉴定引物。张智毓等［4］应用ITS序列对草原珍稀食用菌蒙古口蘑与其相似的草原蘑菇种进行了真伪鉴定，PCR扩增分析结果有效鉴定出了蒙古口蘑，并分析出来自不同地区采集的蒙古口蘑亲缘关系比较近。李晶等［1］采用形态学鉴定方法与现代分子生物学技术相结合将1种野生食用菌鉴定为金山巨菇 （Tricholoma sp．）。

因此，将传统的形态学鉴定方法与现代分子生物学技术相结合，能更客观、真实地反映物种间的差别，而且核糖体r DNA基因转录内部间隔区 （ITS）序列分析可以应用于属下种间及亚种水平的鉴别，从而可以推断出菌株的确切种类［5］。

1 材料与方法

1．1 供试样品

供试样品采集于2012年8月10日在英国诺里奇东安吉利亚大学校区草坪橡树 （Quercus）上 （图1）。将新鲜的子实体烘干后粉碎成粉末并过筛，储存备用。

1．2 子实体形态观察

取子实体完整部分，观察并描述其表面性状、结构、颜色、质地及切面，进行形态学特征初步鉴定。

1．3 DNA提取

称取适量样品粉末，放入研钵中加入液氮碾磨充分破碎细胞，将碾磨碎粉转入离心管种中，样品DNA的提取方法参照改进的CTAB法［6］进行。提取的总DNA经0．8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1．4 PCR扩增ITS序列

图1 生态照

ITS序列上游引物ITS 5：5’－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3’，下游引物ITS4 5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’［7］；扩增反应于Bio－Rad PCR仪上进行。PCR反应体积为25μl，其体系 为 2．5μl 10× Taq Buffer，2．5μl d NTPs （2mmol／L），0．5μl Taq （2U／μl），0．5μl 上 游 引 物（10μmol／L），0．5μl下游引物 （10μmol／L），16．5μl dd H2O，2μl DNA 模板 （100～300）ng／μl。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳，产物和Mark上样量均为5μl，电泳结果于Bio－Rad凝胶成像系统成像。

1．5 ITS片段纯化、测序

根据PCR电泳的结果，目的条带单一特异的PCR产物经Axy Prep PCR清洁试剂盒纯化；有非特异性杂条带的PCR产物经电泳、切胶，收集目的片段，凝胶回收试剂盒回收纯化；纯化后的PCR产物送生工生物 （上海）股份有限公司测序。

1．6 ITS序列比对和同源性分析

将测序获得的序列通过NCBI进行Blast，分析同源性。当物种的r DNA ITS区序列与比对的序列同源性达≥99%，可认为相同种；同源性在95%～99%为相同属；同源性≤95%为相同科［5］。进一步分析相同种或属的分布范围、宿主及比较内转录间隔区1（internal space1 ITS1）；内转录间隔区2（internal space 2）；18S r DNA基因序列，5．8S编码序列，28S r DNA基因序列等信息。

2 结果与分析

2．1 样品子实体形态特征

样品子实体大型肥厚，肉质多汁，复瓦状叠生，基部愈合呈狭细的柄状，侧生，从基部分出若干个大小不相等的扇形或半圆形菌盖，左右数个相连，常十几层重叠在一起 （图2）。幼时颜色鲜艳，表面橙黄至桔红色，有细绒和皱纹，像鸡冠；菌肉白色或浅黄色；后期色渐退，干燥后呈干酪状、硬而脆等形态特征。

图2 子实体形态

2．2 ITS序列扩增

采用CTAB法提取样品子实体基因组DNA，ITS5和ITS4引物进行体外PCR扩增，ITS序列PCR产物凝胶电泳如图3。PCR产物条带清晰单一，片段大小大于600bp以上，与理论值相符。将产物采用PCR试剂盒纯化后送生工生物 （上海）股份有限公司测序。

2．3 ITS PCR产物测序分析

样品经上海生物生工股份公司测序，结果如图4。ITS序列长度为609bp，5．8S片段为159bp（图4方框部分）；G＋C含量为50．9%。

2．4 ITS序列比对

图3 样品ITS序列PCR扩增电泳

图4 样品测序ITS碱基序列

将样品ITS序列在NCBI上进行比对 （Blast）分析，结果如图5。样品与硫磺菌 （Laetiporus sulphureus，登陆号EU840609．1）的DNA序列同源性为100%。结合传统的形态特征鉴定结果，鉴定该样品属担子菌亚纲非褶菌目或多孔菌目、多孔菌科、硫磺菌属，暂命名为硫磺菌种－UK菌株。同时将样品序列提交Genbank，获得登录号为KF897014。

2．5 ITS序列同源性分析

对样品ITS序列同源性进行进一步分析，结果如表1。与样品ITS序列同源性为100%的有2个，登录号分别为EU840609．1和EU840614．1，均来源于瑞典，生长宿主分别是柳树 （Salix babylonica）和栓皮栎 （Quercus variabilis）；同源性为99%的有30个 （表1列出部分），分别来自美国、德国、加拿大、瑞典、丹麦、立陶宛、捷克共和国、乌拉圭和波兰等国家，没有发现英国的报道；宿主来自黑柳（Salix Atrocinrea Brot）、白柳 （Salix alba）、栎树 （Quercus）、栓皮栎 （Quercus variabilis）、桉树（Eucalyptus spp．）、白蜡树 （Fraxinus）和酸樱桃 （Prunus cerasus）等多种树木。

内转录间隔区1（ITS 1）一般在161bp左右；5．8S编码序列一般在159bp左右；内转录间隔区2（ITS2）一般在200bp左右；18S和28S基因序列变化幅度较大。ITS序列一般在500～600bp左右。可见硫磺菌物种的5．8S具有高度保守性，ITS1、ITS2序列中度保守性，与陈剑山等［2］报道结果相一致。

图5 样品与硫磺菌 （登录号EU840609．1）ITS序列比对

表1 样品与同源性100%～99%的硫磺菌ITS序列分析

3 讨论

传统的形态学特征分类法具有易于观察和比较的优势，因其由多基因同时决定，具有相对的稳定性。但传统形态学分类方法也存在不足之处，由于外界的环境条件、表型的可塑性和基因变异等原因，尤其是地域分隔的原因，造成了食用菌种内的形态多样性较高的现象，对种和亲缘种的鉴定存在分歧，因此，引入分子生物学技术作为它们的重要补充，便能提供更多有效的分类信息。现代分类学研究的趋势将以形态学研究为基础，结合分子生物学技术、生物化学、生态学等方法进行综合分类研究，使其在解释系统发育、生物进化和生物亲缘关系上可以获取更多信息，其研究结果更趋于自然。

本研究将传统的形态学鉴定方法与现代分子生物学技术相结合，鉴定该样品为硫磺菌 （Laetiporus sulphureus），ITS序列同源性分析，发现同源性非常高，其中2个同源性为100%，30个为99%，还有同源98%等等；广泛分布于美国、德国、加拿大、瑞典、丹麦、立陶宛、捷克共和国、乌拉圭和波兰等10多国；宿主范围也广，生长在黑柳、白柳、栎树、栓皮栎杨梅、栓皮栎、桉树、白蜡树和酸樱桃等多种树木上。在同源性99%～100%的32个硫磺菌中，没有发现来自英国的报道。英国诺里奇地区气候温和，天气变化频繁，全年雨水丰富，有着丰富的野生菌类资源。因此，本研究是对食用菌—硫磺菌物种资源的分布和宿主范围研究的进一步丰富。

［1］李 晶，林冬梅，林占熺，等．一种野生食用菌的分子及形态学鉴定 ［J］．现代农业科技，2012，（8）：110－111，115．

［2］陈剑山，郑服丛．ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用 ［J］．安徽农业科学，2007，35（12）：3785－3786，3792．

［3］白树猛，田 黎．ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用 ［J］．畜牧与饲料科学，2009，30（1）：52－53．

［4］张智毓，姚庆智，闫 伟．草原珍稀食用菌蒙古口蘑菌种的分子鉴定 ［J］．生物技术，2011，21（3）：40－43．

［5］Landeweert R，Leeflang P，Kuyper T W，et al．Molecular identification of ectomycor rhizal my celium in soil horizons［J］．Appl Environ Microbiol，2003，69：327－333．

［6］臧金平，连 宾，袁 生．简便易行的食用菌菌丝体基因组DNA提取法 ［J］．食品科学，2005，26（3）：66－68．

［7］贾定洪，郭 勇，郑林用，等．野生香蘑属菌株的ITS序列分析 ［J］．食用菌，2010，（1）：21－23．