基于数字编码法的细菌鉴定系统探究

朱敏莹 宋志南

（上海第一生化药业有限公司 上海 200240）

根据表型或者基因型，可将细菌鉴定方法分为两大类，前者有双歧索引法[1]、表解法[2]和数字编码法等，它们经过了多年的研究与归纳，逐步地发展、完善和创新，实现了自动化、商品化、标准化，在现阶段是细菌鉴定的主流方法[3]；后者有G + C % mol含量测定、16S rRNA测序法[4]等，随着分子生物学的不断发展，它将逐步成为主流方法。

1 细菌鉴定的三大传统方法

1.1 双歧索引法

所谓双歧，即二者取一、非此即彼。生化反应的大部分都是定性反应，如革兰染色反应、触酶试验、氧化酶试验等。双歧索引法根据细菌的主要特性和次要特性，按照“非此即彼”的原则依次往下区分，直至将细菌准确区分到最小鉴定单位，即属或种的水平。

这种方法的优点是具有很强的逻辑推断性，思维严谨、思路清晰，所导出的结果明确有力。缺点是每一步都建立在前次实验的结果之上，鉴定过程费时费力，且早期误差易被放大，从而导致完全错误的结果。

1.2 表解法

所谓表解，即是通过表格的形式，列出有一定关联性的细菌进行相同生化试验的结果。《伯杰氏细菌鉴定手册》上有大量的生化反应结果表格[5]，都可以作为此法的判断依据。

表解法主要解决了双歧索引法实验过程冗长的问题。它的优点是可以通过人的主观推理以“走捷径”的方式判断出结果。缺点是可能会因主观判断的失误而影响试验选择的客观性，并导致不易察觉的错误结果。

1.3 数字编码法

通过长时间的实验积累，人们发现对某一种细菌的某一个生化反应而言，其结果虽然是定性的，但却不是完全不变的，即存在一定概率出现与大部分情况截然相反的结果[6]。在实际操作中往往由于这一点，使双歧索引法和表解法存在不可避免的误差。

而数字编码法正是建立在这种反应不确定性的基础上的。它以细菌的各种特性和反应是同等重要的为理论基础，根据每种生化反应在不同细菌中出现的概率进行全面分析而得出结果[5]。作为一种传统的细菌鉴定方法，它结合了双歧索引法和表解法，并通过与数理统计学的学科交叉而产生。

2 API系统的理论基础——数字编码法

2.1 数字编码理论的建立

在长时间的发展过程中，人们发现同一种而不同株的细菌，在同一个生化反应下，结果会发生变化。这个现象一直干扰着细菌鉴定的精确度和准确性。

为了解决这一问题，1962年Beers等[7]提出用概率值来表示某生化试验在指定细菌分类群中的阳性率。这是第一次将数理统计学应用于细菌鉴定学中。1968年Dybowski等[6]用条件概率法对肝肠菌科细菌进行鉴定，首次提出了相对相似百分比PRL（Percentage Relative Likelihood）和模式分数MLF（Modal Likelihood Fraction）这两个数值鉴定参数，这为后续的探索铺平了道路。1970年Lapage等[8]用概率法对279株革兰阴性杆菌进行鉴定，鉴定正确率达到了70%以上，从此基于概率论的细菌鉴定法受到了重视。1973年Lapage[9]继续深入地探索了这一方法，并且建立了科学的细菌数字编码鉴定的数理模型，数字编码法正式得到认可。在这之后，法国梅里埃公司在Lapage的理论基础上提出了参数T值，并建立了可信度评价标准，进一步完善了这一理论。

2.2 数字编码理论的解析

2.2.1 鉴定系统的内部计算方法

细菌数字编码鉴定法以Bayer理论和Lapage理论为基础，以细菌条目、鉴定试验和概率这三大要素为数据，经过统计计算给出结果。

在实践中，学校将课程分为道德、人文、科学、健康、艺术五大学习领域，每一领域又包含基础性、拓展性两类课程。无论是基础性课程，还是拓展性课程，都围绕上面的五个领域落实并强化五种素养。为了提高学生的综合素养，学校还打破学科与学科之间、课内与课外之间、校内与校外之间的壁垒，突破传统课程模式，自主开发了各类综合性课程。目的是通过课程体系的建构、课程方案的落实，实现“为学生的幸福人生奠基”的办学理念。

法国梅里埃公司的API细菌鉴定系统是数字编码法最典型的代表，也是现今使用最广泛的一个鉴定系统。API系统在细菌鉴定方面有15个品种，分别具有相应的数据库。它将需要用到的生化反应全部集成于一个PVC材质的试剂条里，可以达到快速反应读取结果的目的。

以API鉴定系统为例，作为对结果的评价依据所计算的参数有以下几个。

1) %ID值 即鉴定百分率。是每个细菌条目生化反应的出现概率值与该细菌条目所在分类菌群中的所有细菌条目生化反应出现概率值总和的比值。它表示的是每种细菌出现的可能性。以微球菌科为例，表1是截取自API V4.0 STAPH数据库中的反应鉴定表，表中的数字部分表示该细菌条目于该反应的阳性反应概率。

表1 API V4.0 STAPH 反应鉴定表a)（部分）[10]

表中第二行以某一未知细菌的检验结果为例，其%ID值的计算步骤如下：

(1)假设该细菌条目为金黄色葡萄球菌，计算各反应的出现频率。

(2)如LAC为阳性，则该反应的出现频率FLAC=88/100。

(3)如TRE为阴性，则该反应的出现频率FTRE=1–(80/100)。

(4)若阳性反应概率为0或100，则用近似值0.01和0.99代替。

(5)计算每一个反应的出现频率。在一个细菌条目中，将该条目所有反应的出现频率相乘，得出此细菌条目的总出现频率(式1)。

(6)按照上述方法，计算该分类菌群中所有细菌条目的总出现频率。

(7)计算整个分类菌群的多项总发生频率。将该分类菌群中所有细菌条目的总出现频率相加，得到多项总发生频率(式2)。

(8)计算某一细菌条目的%ID值。将某细菌条目的总出现频率除以多项总发生频率，再乘以100，即得到该细菌条目的%ID值(式3)。

2) T值 为某细菌条目的总出现频率除以该细菌条目最典型菌的总出现频率得到的值(式4)。T值代表的是个体相较于最普遍情况的近似性。越接近1，表示鉴定结果的价值越大。

3) R值 %ID按大小排序之后，相邻两项条目的%ID之比，代表两种可能性之间的差距。R值越大，表明结果之间的差距越大，鉴定结果的价值也越大。

2.2.2 API细菌鉴定系统

当使用试剂条后，读取反应的结果，并输入电脑，由梅里埃公司的ATBNew软件计算得出此次结果的%ID值和T值。计算过程完成后，系统会根据%ID的大小，将结果降序排列，并对结果作出评价。具体评价方法如下。

1) 排在第一位的细菌条目%ID≥80时，其评价方法如表2所示：

表2 第一位细菌条目%ID≥80时的评价方法

2) 排在第一位的细菌条目%ID＜80时：

排在前三位的细菌条目%ID之和≥80的，根据这些菌的归类，如果是同一菌种下的不同菌株，则结果为鉴定到种水平。如果是同一属下的不同菌种，则结果为鉴定到属水平。鉴定的评价则为他们%ID之和，再依据上节所述作出。如果既不属于同一种，也不属于同一属，则结果为低分辨率。

如排在前三位的菌名%ID之和仍然＜80，则结果为不可接受。

2.3 数字编码法的发展

西方国家在20世纪70年代就开始此方面的研究，由于起步较早，他们的产品已经具有很高的专业化、自动化、商品化、标准化的水平。其中具有代表性的有梅里埃 API系统，Vitek 系统[11]，Microscan Walkaway[12]和BD Phoenix[13]等。国内在这方面的研究从20世纪90年代才开始，起步较晚，但也有不少具有代表性的产品，如杭州天和HW-138细菌鉴定分析仪[14]、山东鑫科XK-3401自动微生物鉴定及药敏分析系统[15]等，上海华山医院也有自主研发的肝肠菌科细菌鉴定板条[16]。

总体来看，进口产品因为其准确度高、配套设备成熟等原因，占据着主流市场，但又由于其技术垄断，因此售价较高，使检验的成本居高不下。但随着国内技术的前进，两者之间的差距会越来越小，因此可以期待有更物美价廉的产品出现。

3 数字编码法在实际应用中需注意的问题

根据上述细菌鉴定方法的原理，可以知道要通过传统方法使鉴定结果完全可信是不可能的。根据式1、式2、式3可知，因为F细菌条目＜F总，所以%ID＜1，即鉴定结果的可信度始终不会是100%，即使是标准菌株，其%ID值也不会为1。因为这个方法建立在概率论与统计学的基础上，支撑它的是前期大量数据的积累所形成的数据库，但数据的积累都有局限性，而且其本身的算法也决定了%ID只可能接近1，而不可能等于1。

在平时的检验过程中，即使排除了操作上的误差，也仍将难以避免地遇到低分辨率或鉴定失败的结果。因此，必须在实际应用中理性地审视实验结果，既不能因为鉴定结果的%ID值相对较低而否定结论，也不能因为%ID值相对较高而迷信结论。这是传统细菌鉴定方法无法回避的一个局限性，但这并不代表实验的结果完全没有价值，我们可以通过一些方法来改善这一问题。

为了提高结论的准确度和可信性，我们大致可以采用以下两种方法。其一是复核试验法，根据鉴定结果选择一个或几个生化反应进行复试（我们一般依照表解法的思路来进行选择），再根据复试结果来评价鉴定结果。其二是平行试验法，即采用两种方法或两个系统进行平行试验、比对结果，例如同时使用API系统和16S rRNA序列分析法。

4 各鉴定方法的优缺点比较

双歧索引法和表解法作为最传统的方法其优点是硬件条件要求低，缺点是准确度不高，检验时间长、效率低，难以商品化、自动化。

数字编码法的优点是实验简单、快速，初期投入成本较低，上手难度低，准确度较高，缺点是只能鉴定到种，实验精度不够，耗材成本较高。

16S rRNA序列分析法作为分子生物学细菌鉴定方法的代表，其优点是准确率和可信度高，实验周期短、精度高，可以进行同源性分析，缺点是相关的仪器较昂贵，对实验人员素质要求较高。但随着技术的完善，这一类方法在当下已渐渐普及，也将成为今后的主流。

5 结语

随着质量技术系统的不断发展，细菌鉴定必将成为一个常规检验项目，在选择和建立检验方法时要对各现有方法进行充分的比较。我们经过实践和总结，认为在初期应选用以数字编码法为基础的检验方法，既能达到准确快速检验的目的，也能兼顾成本、提高人员素质。

但在使用API等方便快捷的细菌鉴定试剂条产品时也会出现一些问题，如轻视传统的基础实验、对成熟的、商品化的产品过分信任和依赖等。这些问题会表现在如仅通过%ID和T值就断定结果而忽视补充实验[17]、出现不可接受的结果时不从划线分离等最基本的步骤开始找原因。因此在使用这类快速鉴定产品时仍应保持客观性，尤其在确定建立方法的初期，更应熟悉所用方法的原理和内涵，熟练基础生物化学实验的操作。即便是基因水平的新方法，也离不开最基本的微生物实验操作，而对基本操作的忽视，会成为实践中最大的潜在问题。

此外，应当认识到传统方法本身的局限性，基于分子生物学的方法在将来成为主流是大势所趋。建议在积累了一定数据和经验之后，可以逐步尝试16S rRNA测序法。

总之，对于普通企业而言，应当从简到难、逐步深入、夯实基础，不能跨越式地追求最新的方法。

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