PCR DGGE 技术及其在食品菌相分析中的应用

姚来斌，孔保华 ，李沛军，刘 骞，夏秀芳

(东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030)

食品中含有一个复杂的微生物生态系统，由于它的化学和物理特性，很容易成为微生物繁殖的底物［1］。长期以来，人们都是通过传统培养、分离和显微镜鉴定的方法来研究肉类制品中微生物的变化情况［2］，而这种传统的方法并不能完全反映真正的微生物多样性和动力学变化。研究人员推测自然界中有85%～90%的微生物至今还不能被培养［3］，这就给研究带来了困难。在近十年间，PCR-DGGE 技术以其可靠性强、重现性高、方便快捷等优点，逐渐取代了肉类制品中菌相变化研究的传统培养方法。该技术可以用来研究不同微生物之间的差异，也可以分析相同微生物不同储藏时期的变化情况［4］。

1 PCR-DGGE 概述

20 世纪80 年代，由Fischer 和Lerman［5-6］提出一种快速检测DNA 片段点突变的技术，即变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技术。1993 年Muyzer 等［7］在研究微生物的遗传多样性和菌群差异方面利用了该技术的优点，首次将该技术应用到微生物的菌相变化研究中。近几年，PCR-DGGE技术已经应用到了肉类及肉制品的菌相变化研究中。

DGGE 可以将长度相同而序列不同的DNA 片段分离开。该技术基本原理是［8-9］:双链DNA 分子因其内部核苷酸的排列顺序不同而具有不同的解链温度。在含有不同变性梯度变性剂(尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中，不同分子量的双链DNA 分子进行电泳时会有不同的解链温度，DNA 序列的不同会导致不同的解链速度和程度。当双链DNA 分子迁移到凝胶的特定位置并达到适宜的解链温度时，就会开始部分解链。同时，DNA 分子的迁移速度与其解链程度成反比，从而会使不同的DNA 片段在凝胶的不同位置停留，最后形成分离开的不同带谱。理论上来说，只要电压、变性梯度、电泳时间等条件选取适当时，所有存在差异的DNA 片段都可以被分离开。

DNA 分子是由A、T、G、C 四种碱基构成。其中G、C 碱基结合的力比A、T 碱基要大，所以G、C 碱基含量多的DNA 分子就会有越高的解链温度。因此，我们将“GC 夹板”(GC-clamp)技术应用到PCRDGGE 中，人工制造一个高温解链区域，即将一段含有较多G、C 碱基的DNA 碱基片段人工添加到待解链的DNA 双链一端，因此不同的DNA 就会由于不同的解链温度而实现较精确的分离［10-11］。

DGGE 技术主要的操作步骤［12］:前期预处理样本;提取和纯化样本DNA(或RNA);对样本中16S rRNA 基因或基因片段的PCR(或RT-PCR)扩增反应;DGGE 反应过程中条件的优化;制备凝胶;样本的DGGE 分析;DGGE 图谱的分析;条带序列分析。

2 PCR-DGGE 技术的优越性

2.1 经济、快速、准确地动态检测食品中的微生物

在非培养状态下直接提取样品中微生物的DNA，随后进行PCR 扩增，得到DGGE 图谱，在DGGE 中得到不同微生物的分离条带［4］，每一个独立的条带都代表一个物种。随后经过割胶、测序等步骤，就可以在基因库中和已知微生物的序列进行对比，达到快速检测微生物的目的。

Muyzer 等［7］用PCR-DGGE 方法检测出了数量占群落总数1%的微生物。Omar 等［13］经过大量实验证实PCR-DGGE 技术的微生物检测极限为1%～3%，如果同时结合rRNA 杂交技术，还可以将检测极限降低至0.1%左右。DGGE 技术可以根据实际需要，对食品生产和储藏等环节做出准确、快速的菌群多样性和动态检测［14］。同时，DGGE 技术可以同时分析多个样本，尤其是食品发酵过程中微生物的变化情况。所以该技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优势，并且可以应用到食品的微生物研究中。

2.2 能与其他多种方法结合

PCR-DGGE 技术可以与多种方法结合，以达到准确认识微生物的组成、菌相的变化等目的。实际上，结合其他方法(如传统平板培养、杂交技术、克隆测序技术等)以后，PCR-DGGE 技术将会成为菌群多样性和菌相动态变化研究的有力工具，从而提供微生物群体变化和多样性等信息。

3 PCR-DGGE 技术的缺点

3.1 样品制备过程中存在微生物污染

虽然PCR-DGGE 技术有着明显的优点，但是其中也存在不足。在实验过程中，前期清洗、混匀、冷冻、离心或培养阶段都会使样品感染微生物，而使测量结果中鉴定出多余菌种。DNA 的提取过程中也会因为空气中微生物的影响而导致DNA 的提取不够精确，从而影响提取的浓度和检测限［15］。

3.2 食品成分越复杂，DNA 抽提就越困难

由于食品中含有蛋白质、脂类、碳水化合物、盐类等成分，这就会导致杂质的去除存在困难，DNA 的抽提也会更复杂。这些杂质会成为后续实验步骤的阻碍，所以在进行PCR 扩增之前要对提取的DNA 进行纯化。

3.3 产生优先扩增现象

1992 年Reysenbach 发现在进行PCR 扩增时，rDNA 基因存在优先扩增的现象，导致部分的DNA不能被扩增，因此不能真实反映原菌落结构。在扩增过程中还会产生嵌合体和异源双链，从而影响DGGE 图谱的分析［16］。

3.4 DNA 分离及测序的局限性

DGGE 只能分离较小的DNA 片段(1kb 以下)，这就限制了菌种的分析量，导致一些菌种不能被鉴定出来［17］。同时，有些微生物有多个操纵子，使DGGE 图谱中出现多个同种微生物的条带，从而导致微生物多样性被过高估计。若实验条件不适宜，则不能完全分开有序列差异的DNA 片段，产生DNA 共同迁移的现象。

4 PCR-DGGE 技术在食品微生物菌相研究中的应用

4.1 发酵食品

发酵食品是利用有益微生物进行加工制造的一类营养食品。同时，发酵食品很容易被微生物污染，其中的微生物多种多样，并且在不同发酵时期微生物的动态变化也不同。分子生物学的发展给发酵过程中菌相变化的研究提供了一个有力工具。通过DGGE 方法研究后发现，发酵食品在发酵期间和成熟期间的主要优势菌是清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)，同时还伴有木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。

4.1.1 发酵香肠 Kesmen 等［18］使用传统培养和独立于培养的分子学方法鉴定了一种土耳其发酵肠中的乳酸菌的菌落结构。一方面，使用PCR-DGGE 的方法来对微生物16S DNA 的V1 和V3 区域进行分析。另一方面，使用细菌基因组重复序列PCR 技术(rep-PCR)对16S rDNA 和16S～23S rDNA 基因间隔区域进行分析，之后对微生物进行主要的区分和菌株的分组。最后通过PCR-DGGE 分析，鉴定到了8种不同的乳酸菌。

Lu 等［19］研究了发酵肠接种不同初始菌之后的变化情况，鉴定中使用了传统培养和非培养的方法。起初接种了香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)和腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)的香肠，在两种鉴定方法中发现，都可以对微生物有比较有效的抑制作用。在接种不同初始微生物的发酵香肠中，前两天内的pH 并没有很大的差别。

4.1.2 发酵乳制品 传统西西里羊奶酪和实验室制作的羊奶酪之间品质有所差异，并且添加初始菌种不同也会导致不同的风味。Randazzo 等［20］针对两种奶酪进行了实验，分别向原料奶和巴氏杀菌后的奶中添加初始菌种，随后分析不同奶酪样品中微生物的多样性和动态变化。PCR-DGGE 分析结果显示，两种奶酪中微生物的数量和分类十分相似，其中的菌株主要包括嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。传统方法和分子学方法比较之后发现，两种奶酪的优势菌也基本相似。

4.1.3 发酵谷物 大酱是韩国传统的发酵型豆瓣酱，由于含有丰富的蛋白质而被韩国人推崇。Kim等［21］分析了5 个工厂制作大酱产品和5 个家庭大酱制作产品。对微生物16S rRNA 基因V3 区域进行的DGGE 图谱结果显示，在大酱中乳酸菌(Lactic acid bacteria)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)是主要的菌种，而被人们认为是主要优势菌的芽孢杆菌(Bacillus)在检测中并没有发现。然而使用针对于芽孢杆菌的特殊引物来进行选择性PCR 扩增时，在一些大酱样品中鉴定到了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。利用DGGE 的方法，在不同的大酱样本中都检测出了微生物的多样性，并且DGGE 图谱的聚类分析还揭示了大酱产品中微生物的动态变化情况。

Leite 等［22］使用传统培养和PCR-DGGE 的方法来研究三种不同的巴西谷物中微生物的群落结构和多样性。PCR-DGGE 结果显示在三种谷物中，马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)和高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)是主要的微生物，并且菌落的产生主要是依靠酿酒酵母的作用。

4.1.4 发酵酒类 Mills 等［23］通过对比葡萄酒发酵过程中酵母的多样性和动态变化，证明非啤酒酵母的生长受发酵温度的影响。通过对PCR 扩增反应中获得的26S rDNA 基因进行DGGE 分析之后，证实在发酵过程中假丝酵母一直存在。发酵后期假丝酵母的条带仍然存在，但是非啤酒酵母的含量明显降低。

4.1.5 其他发酵制品 橄榄鲜果储藏一段时间后会被乳酸菌感染，最终导致不能食用。Randazzo 等［24］评价了发酵过程中橄榄表面菌群数量的动态变化，同时在不同发酵过程中接种了不同剂量和种类的初始菌。平板培养结果显示在培养基中发现了不同浓度的微生物，并且揭示了初始乳酸菌的有益作用，它会抑制肠道杆菌(Enterobacteriaceae)的生长。此外，DGGE 结果显示盐水条件的改变没有增加李斯特菌(Listeria)的生长。

4.2 非发酵食品

4.2.1 肉类制品 伊比利亚火腿表面经常会出现和微生物有关的“黑斑”，人们长久以来都不清楚是何种微生物导致了这种现象。Andrade 等［25］针对微生物16S rRNA 进行分析，使用分子学方法对火腿的“黑斑现象”进行了研究。在后盐阶段前期，分离到了几个微生物菌株，然而只有一个菌株是与“黑斑”的产生有关，对这个菌株的16S rRNA 进行检定后发现，它是假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

Hu 等［26］使用16S rDNA-DGGE 系统发育分析的方法揭示了切片真空包装火腿在4℃储藏的过程中微生物的动态变化和主要的腐败菌。该研究从火腿中直接提取微生物总DNA 后，先使用了传统培养的方法，随后用巢式PCR 和降落式PCR 的方法对16S rDNA 的V3 可变区域进行了扩增，最后使用DGGE图谱分析。结果发现清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)是主要优势菌。

牛肉经常被腐败菌污染而导致其货架期缩短，所以了解牛肉储藏过程中微生物的种类和动态变化就显得尤为重要。Ercolini 等［27］鉴定了牛肉冷藏过程中导致腐败的微生物菌种，并且研究了使用抗菌包装对于牛肉储藏的意义。他们使用含有乳酸链球菌素(Nisin)、盐酸(HCl)和乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液组成的抗菌包装，并且将此包装应用到切片牛肉中。此后，监测包装中与腐败相关的优势菌。结果发现，使用抗菌包装会对一些革兰氏阳性细菌起到很好的抑制作用，比如肉食杆菌(Carnobacteria)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)和热死环丝菌(Brochotrix thermosphacta)。与对照组相比，它们的生长在至少前11 天都得到了控制。这些微生物的鉴定是使用PCR-DGGE 对直接从肉中提取的DNA 的16S rRNA 基因的分析得到的。与传统培养方法进行比较后发现，改变储藏条件，主要的微生物菌种并没有改变，只是数量上有了差别。

Li［28］使用传统平板培养结合DGGE 技术的方法研究了猪胴体剥皮和非剥皮两种工艺过程中菌相的动态变化，以及不同储藏条件、时间对微生物多样性的影响。以屠宰和储藏过程中微生物的总DNA 为模板，对16S rDNA 的V6～V8 区进行PCR 扩增，显示出了不同屠宰过程中微生物的不同菌落结构。研究证明，使用不同的屠宰工艺会对猪肉中微生物的多样性带来影响。同时对冷却猪肉在不同储藏条件下菌相的变化进行了研究，DGGE 结果表明，氧气充足的储藏过程中主要优势菌为:热死环丝菌(Brochothrix thermosphacta)，莫拉氏菌(Moraxella sp.)，气单胞菌 (Aeromonas sp.)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，葡萄球菌(Staphylococcussp)和节杆菌(Arthrobacter sp.)。

Han 等［29］研究了高压对切片火腿中腐败微生物的抑制作用，分别使用了传统培养和PCR-DGGE 方法。为了准确描述菌落结构和压力处理之后的优势菌，所以将平板分离出的细菌总DNA 和直接从火腿中提取的总RNA，分别进行PCR-DGGE 分析和16S rDNA 的V3 可变区域的RT-PCR-DGGE。DGGE 图谱结果分析显示，切片火腿高压处理过程中存在的微生物有多种，但是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)得到了明显的抑制。然而高压处理后，绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)和魏斯氏菌(Weissella)依然存在，并且成为最后的腐败菌。

Russo 等［30］研究了肉类产品腐败微生物中热死环丝菌的变化情况。收集肉上散落的微生物之后，直接提取DNA，PCR 扩增之后用于DGGE 分析。经过测序发现，主要的腐败微生物为热死环丝菌(B.thermosphacta)，假单胞菌(Pseudomonas spp)，肠杆菌(Enterobacteriaceae)和乳酸菌(Lactic acid bacteria)。本项研究中发现随着储藏时间的延长，热死环丝菌的减少是因为乳酸菌的存在。

孙彦雨等［31］对储藏了0、3、5、7、9 天的冰鲜鸡进行微生物多样性研究，通过提取鸡肉中菌种的总DNA，通过使用PCR-DGGE 技术，将微生物的16S rDNA(V6～V8 区域)的PCR 扩增片段割胶测序，最后鉴定样品中的微生物群落，同时和传统培养方法的结果进行了对比。结果发现，初始阶段存在数量较多的菌种不一定是最后导致腐败的优势菌，其中导致鸡腿肉和鸡胸肉腐败的菌种有一定区别，在低温低氧分压环境中存活的微生物会导致最终的腐败。传统平板培养方法和PCR-DGGE 得到的导致腐败的优势菌不完全相同。

4.2.2 鱼类制品 Hovda 等［32］研究了养殖的大西洋鳕鱼在气调包装后菌群的变化。PCR-DGGE 结果显示氧气浓度较高的包装中假单胞菌(Pseudomonas spp.)成为了主要优势菌，而CO2/N2和空气包装中，主要腐败微生物是发光杆菌(Photobacterium sp.)，腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)和假单胞菌(Pseudomonas spp.)。同时Hovda［33］还对气调包装中的比目鱼进行了PCR-DGGE 研究，分析了不同气体浓度的气调包装中优势菌的变化情况。

4.2.3 其他食品 Dina 等［34］针对农场大批散装奶和工厂生产的奶分别使用DGGE 和克隆的方法进行了微生物群落的研究。两种方法均显示，在冷藏条件下微生物的多样性有所下降。牛奶在冷藏之后，假单胞菌(Pseudomonadales)成为了优势菌。农场的样品和工厂的样品间微生物的组成有所不同，前者以革兰氏阳性细菌为主，包括梭状芽孢杆菌(Clostridia)和放线菌(Actinobacteria)，后者主要是革兰氏阴性细菌。尽管假单胞菌(Pseudomonadales)在原料奶长期冷藏之后成为主要腐败菌，但是放线菌(Actinobacteria)的出现，成为了评价牛奶品质的主要微生物。

5 PCR-DGGE 技术的应用前景

长久以来，人们都是通过传统平板培养的方法来研究食品中菌相的多样性和动态变化。由于传统的方法在操作过程中会引入污染菌，同时只有少部分的微生物可以模拟自然生长环境进行培养基培养。

分子生物学方法是一个快速崛起的技术，用它来鉴定食品中的微生物系统是其中的一个分支。使用分子学技术来研究食品中菌相变化是对传统培养方法的有力补充，这样会让我们更准确、全面、快速的认识微生物在食品中的动态变化。

PCR-DGGE 技术由于检测速度快、可靠性高、重现性强等特点逐渐被人们接受。虽然PCR-DGGE技术还不够成熟，操作过程中可能会产生优先扩增和异源双链等现象，但是现阶段已经通过巢式PCR和降落式PCR 将影响降低到最低限度，今后该技术将会成为研究食品中菌相变化的最有力手段之一。

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