水生生物来源透明质酸的生化特性及其制备的研究进展

陈 辉，于 刚，高瑞昌，吴燕燕，戚 勃，马海霞，陈胜军，*

(1.江苏大学，江苏镇江212013;2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东广州510300)

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种糖胺聚糖，在人体内广泛分布，大于50%的HA 分布在人体的皮肤、肺、肠道中，在血液、关节滑液、脐带中也有分布［1］，其为人体的正常生理活动发挥着重要作用，如影响细胞的增殖和分化［2］、调节蛋白质、润滑关节、调节血管壁的通透性、创伤修复等［3］;HA 是目前为止发现的最好的天然保水剂，在皮肤保水方面发挥着重要的作用。自从哥伦比亚大学教授Meyer 等人［4］于1934 年首次从牛眼玻璃体中分离获得透明质酸以来，有关透明质酸的研究一直生生不息，透明质酸也因其优良的性质在食品、医学、生物等方面获得广泛的应用，目前开发新的HA 产品成为热门的研究趋势。早期用来提取HA 的主要为脐带，但由于原材料获取困难，使得生产成本增加，同时感染病毒的陆生生物组织提取的HA 通常含有一些病原菌，使得产品的安全性存在问题，因此研究利用相对安全的水生生物组织作为提取HA 的原料具有较大的实际价值，虽然从不同原料、采用不同的制备方法获得的HA 分子量不同，但都有着相似的分子结构、无种属差异、无抗原性，这为水生生物透明质酸的广泛应用奠定了基础［5］。目前用于提取HA 的水生生物组织主要有鱼眼玻璃体［6］，蛙皮［7］、鱼体粘液、淡水蚌肉汁水等。孙智华等人［8］研究利用泥鳅粘液提取透明质酸，理化性质分析表明提取物含有氨基己糖、已糖醛酸，利用红外光谱分析发现提取物同HA 标准品的扫描图谱完全一致;王大为等人［9］利用林蛙皮提取出高纯度的HA，研究表明其保湿性好、安全性高。

1 透明质酸结构及理化性质

1.1 HA 的结构

20 世纪50 年代，卡尔·迈耶［10］实验室阐明了透明质酸的化学结构。透明质酸是一种高分子的聚合物，由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺通过β-1，3-糖苷键连接成二糖单元，然后由无数个这样的二糖单元通过β-1，4 糖苷键形成无支链的多聚物。分子中两种单糖的摩尔比接近1∶1，双糖单位可达30000 之多，透明质酸的分子量在10 万到400 万之间［11］。电镜扫描显示HA 分子为一直链［12］。β-1，3-糖苷键、β-1，4 糖苷键的交替存在使得HA 上的官能团均匀的分布在直链的两侧［13］，直链上的羟基定向排列，同时由于直链上单糖之间的羟基形成氢键，使得分子呈刚性的螺旋结构，其半径为200nm，达到一定浓度时HA 分子相互缠绕形成网状三维结构［14-15］。

1.2 HA 的理化性质

1.2.1 物理性质 透明质酸溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂，从水生生物组织提取的HA 为白色粉末状。透明质酸溶于水时，由于葡萄糖醛酸的羧基解离使其带有负电荷，因此HA 具有酸性多糖的性质［16］。

1.2.2 生化特性 HA 的特殊结构赋予HA 强大的保水性能，通过氢键和极性键的作用能将水分子固定在螺旋柱中［11］，使得HA 亲和的水分子相当于自身重量的1000 倍［7］，HA 的保水能力随着分子量的增大而增大，从水生生物提取的HA 分子量通常较大，因此其保水性能相对较好。

HA 水溶液具有特异的流变学性质，拥有良好的粘弹性，其粘弹性大小取决于HA 的分子量和溶液浓度，分子量越大、浓度越高粘弹性越好［7］，合理的改变HA 的分子量和溶液浓度均能获得较好的粘弹性。除此之外，溶液的pH、温度、离子强度也会对HA 溶液的粘弹性造成较大影响。透明质酸是非牛顿性流体，具有假塑性。

1.2.3 降解反应 HA 的分子量具有很大的分散性，天然HA 的分子量分布为105～107u。水生生物来源HA 分子量通常较大［6-7］，可以将其降解，形成分子量为1 × 104～5 × 105u 的 低 分 子 量 透 明 质 酸(LMWHA)［17］。LMWHA 具有高分子量HA 不具备的生物活性，例如抗氧化［18］、免疫调节［19］、促进伤口愈合、促血管生成［20］、抗肿瘤［21］等，因此其在医学上具有广阔的应用前景，近年来LMWHA 的生物活性越来越受研究者的关注。研究表明，HA 降解主要是由水解和羟基上的活性氧引起的，紫外线、超声波［22］、γ 射线［23］均可使HA 发生降解，目前用于降解HA 的方法主要有化学法、酶法、物理法。物理法因其操作简单、对HA 结构破坏小、节能环保等优点而成为研究的热点。

Miyazaki 等人［24］研究了超声波对HA 的降解作用，研究表明影响降解的因素主要有声强、温度、HA浓度、离子强度。温度越低越有利于HA 的降解;强度越大降解效果越好，HA 分子量的变化与波强成对数关系;HA 溶液浓度过高或过低都不利于超声对HA 的降解，应保持一定的流动性;离子强度影响HA的空间结构，因此其对降解也造成一定影响。

李腾飞等人［17］研究了化学-超声联用的方法对HA 的降解作用，首先分别单独应用化学法、超声法降解HA，得到最佳降解条件分别为:使用NaClO 于4℃下降解HA、使用800kHz 和1.7MHz 双源超声降解HA，然后进行化学-超声联用法降解HA，快速降解得低分子量透明质酸和寡糖透明质酸，该法节能快速，获得的HA 分子量低，可以达到实际应用要求。

王菁等人［25］利用H2O2和抗坏血酸结合的方式对鱿鱼眼HA 进行降解，在适宜的条件下得到相对分子质量为5433 透明质酸;代琼等人［26］从鱿鱼眼提取出纯度较高的HA，然后采用H2O2和抗坏血酸结合的方式将其进行降解，并对HA 降解前后的性质进行研究，结果发现HA 降解前后都具有保湿性和抗氧化性，且表现出分子量相关性。

2 提取方法

目前应用于制备HA 的方法有组织提取法、微生物发酵法、人工合成法，水生生物透明质酸的提取主要采用组织提取法。

组织提取法的一般流程为:预处理、浸提、盐析、去蛋白、脱色、季铵盐络合、解离、醇沉、干燥。提取法优点在于工艺流程简单，获得的HA 分子量较大，一般都大于60 万，溶液粘度高，保湿性能好，但在动物组织中HA 通常与蛋白质结合，且组织中含有其他多糖类物质，给HA 的提取带来不便［27］，因此高效、经济的去蛋白、分离纯化技术成为研究的重点之一。

组织提取法主要包括:水提取法、中性盐盐提取法，近年来，随着多糖类物质的深入研究，新的提取分离手段也在不断的被引进和尝试，目前针对水生生物中透明质酸的存在方式而提出的提取方法还有超声波、酶提取法等，新方法的引入为水生生物透明质酸的提取、应用带来了广阔的前景。

2.1 中性盐提取法

无机盐的加入可以解除水生生物组织中透明质酸与蛋白质的络合，从而利于透明质酸溶解在水中，且适量盐浓度可以使蛋白质盐析，从而减少提取液中杂质蛋白质的含量、提高HA 的浓度。但该法提取率较低，且引入新的杂质。孙智华等人以泥鳅粘液组织为原料，用10%的氯化钠溶液提取得到粗提液，加入氯仿初步去除蛋白质，然后进行酶解，之后采用醇沉、季铵盐络合法进一步纯化，最终的产品得率为1.96%，核酸含量＜0.35%，蛋白质含量＜0.54%［8］。

2.2 酶提法

酶能水解蛋白质、核酸等杂质，此外，酶能解除HA 和蛋白质之间的作用，利于水生生物HA 的提取，因此酶提法获得的产品蛋白质、核酸等杂质少，提取效率高。

目前研究较多的酶有中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶。由于提取原料的不同，各种酶对其的作用效果也有差异，张丽媛等人比较了中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶对金乌贼眼透明质酸的提取效果，结果表明中性蛋白酶提取效果最佳，利用该酶提取的粗提液经三氯乙酸去蛋白、季铵盐络合、乙醇沉淀纯化后HA 的提取率为10.70%［28］;卢佳芳等人利用枯草杆菌蛋白酶在酶用量4%，酶解温度60℃的条件下酶解1h 提取鱿鱼眼透明质酸，粗品提取率为14.10%，用D101 大孔吸附树脂进行脱色，通过超滤除去小分子杂质，最后利用DEAE -Sephadex A-25 离子交换柱分步洗脱得到HA-1、HA-2两种组分，HA-2 占89.60%［27］。

合适的pH、温度、时间不仅可以使酶发挥最佳的水解功效而且可以有效防止HA 的降解，汪建等人报道了将pH 控制在8～9，利用粗胰蛋白酶水解原材料，经硅藻土过滤、乙醇沉淀得HA，收率为0.4%～0.6%，平均分子质量4.0 ×105～1.0 ×106，蛋白质含量为5%～15%，葡萄糖醛酸为20%～28%［29］。梁天佐等人［30］报道当温度达到50℃时，透明质酸就会发生较大的降解。谢镇等人［31］报道了利用胰蛋白酶提取透明质酸，最适温度为45℃，此时提取率最高，HA 的分子量损失率也较少。

3 透明质酸的纯化

3.1 蛋白质的去除

透明质酸的提取过程中蛋白质是主要的杂质成分，蛋白质的去除效果直接影响HA 的质量和应用，因此必须去除蛋白质，常用的蛋白质去除方法有:加热法、三氯乙酸法、等电点法、氯仿法、Sevage 法。

加热法操作简单，但去除蛋白质效果不佳，不能完全去除蛋白质，同时高温下长期操作会引起透明质酸的降解，因此一般很少采用。三氯乙酸法操作简便、作用条件温和、一般不会引起透明质酸的降解，但蛋白质的去除效果不理想，一般达不到行业标注的要求。

3.1.1 等电点法 蛋白质为两性分子，溶液处于等电点时蛋白质的溶解度最低，因此将pH 调节到蛋白质的等电点则会使蛋白质沉淀，从而分离纯化透明质酸，研究表明透明质酸提取液杂质蛋白质的等电点一般为4～5，因此经常将pH 调节到4～5 以去除蛋白质。等电点法操作简便、蛋白质去除效果好、对产品的破坏小。姚美琴等人发现当pH 为4 时溶液蛋白质含量最少，因此其将提取原液pH 调节至4，静置一段时间，可以去除大部分蛋白质，然后利用超滤法除去小分子多肽类，产品的得率为2.96%，纯度为72.21%，葡萄糖醛酸为33.5%、蛋白质为3.06%［32］。但不同的蛋白质等电点不同，该法并不能完全去除蛋白质，高向东等人将HA 粗品溶解之后过滤，然后利用氢氧化钠和盐酸溶液将HA 溶液pH 反复调节至10～10.5 和6～6.5 以使不同的蛋白质沉淀，获得了理想的蛋白质去除效果，产品蛋白质含量只有0.04%，葡萄糖醛酸含量为47.2%［33］。

3.1.2 氯仿法 氯仿可以使蛋白质变性沉淀，从而可以用来纯化HA，多余的氯仿可以利用乙醇去除，溶剂残留量低、蛋白质去除效果较好［34］。此外氯仿处理可以除去致炎物质，不但能防止提取过程中提取液的腐败而且能提高产品的安全性。但该法纯化时透明质酸的损失较大，且氯仿等有机溶剂对透明质酸有一定的破坏作用，可能影响HA 的生理活性，加上其操作繁琐、耗时长等原因使其不适于工业化生产。高向东等人［33］研究发现氯仿法可以使产品的蛋白质含量降低到0.69%，但HA 的回收率只有57.1%;郭学平等人［34］报道了利用胰蛋白酶水解鸡冠提取HA，将得到的粗品溶解，加入少量的氯仿防腐，再加入两倍体积的氯仿去除蛋白质，结合链霉蛋白酶酶解、季铵盐络合、乙醇沉淀精制HA，得到的HA达到药用级的要求。

3.1.3 Sevage 法 一般加入提取液1/5 体积的氯仿，然后加入1/5 氯仿体积的正丁醇，混合均匀后剧烈振摇20～30min 形成乳化液，此时蛋白质发生变性，溶液呈胶状，去除水层和溶剂层交界处的变性蛋白即可纯化HA［32］。该法反应温和，对多糖的结构影响不大，为多糖纯化时常用的去除蛋白质方法，但每次去除变性蛋白质时会有多糖的损失，且该法效率较低，往往重复多次才能达到理想效果，同时其不能去除和多糖结合的蛋白质。李知敏等人利用Sevage 法去除蛋白质4 次，效果仍比不上三氯乙酸法，且多糖的损失率高达42.3%［35］。

3.2 透明质酸的精制纯化

目前用于分离透明质酸的方法多种多样，文献报道的有季铵盐法、乙醇沉淀法、离子交换层析法、凝胶层析法、过滤法、超滤法等。

3.2.1 季铵盐络合法 目前经常用的季铵盐有CPC［36］(氯代十六烷基吡啶)、CPB(溴代十六烷基吡啶)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，季铵盐在水溶液中带正电荷，而HA 在水溶液中带负电荷，两者在低浓度的盐溶液中络合形成沉淀，在高浓度的盐溶液中沉淀又发生解离，形成游离的透明质酸，从而达到透明质酸的分离纯化的目的。该法能除去不和季铵盐络合的杂质，效果好，得到的产品纯度一般较高［7］。因CTAB 法生产成本较CPB、CPC 络合法低，故其逐步成为研究的热点，刘丽等人［37］报道利用CTAB 络合法结合乙醇沉淀法纯化HA 提取液，先向提取液中加入15%CTAB 溶液于35℃下沉淀2h，然后用70%乙醇于4℃下沉淀，HA 收率可达96.62%，蛋白去除率达86.09%。梁天佐等人［30］利用乙醇沉淀法结合CPC 络合法纯化HA，其得率为92.1%，该法获得的产品达到了化妆品级的要求。

3.2.2 乙醇沉淀法 向溶液中加入乙醇使得其极性发生变化，从而导致透明质酸的溶解度降低。乙醇沉淀法纯化透明质酸的效果与原液中透明质酸的浓度有关，当HA 浓度为1%～2%时沉淀效果最好，浓度太大时沉淀不完全，浓度太低乙醇耗量太大;乙醇用量一般为溶液体积的2～3 倍;乙醇的浓度对HA 的得率也有较大影响，随着乙醇浓度的增加HA 的得率增加。丁霞等人［38］研究指出使用2 倍及2 倍以上的乙醇能将HA 从溶液中沉淀出来，损失少，且保证溶液中一定的盐浓度有利于HA 的沉淀，产品中多余的盐可以采用透析法去除。醇沉时可先将pH 调节到一定值，这样有利于HA 的沉淀，李润等人［39］将pH调节到碱性，使得立即产生沉淀，沉淀完全后调回中性，防止HA 降解。

3.2.3 物理方法 目前研究较多的物理纯化方法有离子交换层析、微滤、超滤、透析、过滤法等。

离子交换层析法是常规的制备较高纯度HA 的方法，但成本较高、操作复杂、有些材料还需要对树脂进行修饰［40］。故一般用于医用级透明质酸的生产。叶华等人［41］报道了选用201 ×7 阴离子交换树脂填柱，进行双浓度洗脱得到了医用级HA;微滤、超滤一般用来去除提取液中的小分子物质，超滤还可以用来浓缩提取液从而减少乙醇的用量，减少生产成本，也有报道指出将微滤和超滤结合作为主纯化技术来纯化透明质酸，周海东等人［42］利用PVDF 材质的膜分离纯化发酵液，用微滤去除菌体，超滤去除蛋白质及其他小分子物，实现HA 的分离提纯;过滤法一般用来获得澄清的提取液，过滤法生产成本低，操作简单，且对HA 的破坏较少，因此有一定的应用前景，盛瑞堂等人［43］提出了用过滤法分离纯化透明质酸的工艺，结合超滤、乙醇结晶得到的产品葡萄糖醛酸含量达44.2%，蛋白质含量为0.01%，收率高达90.5%。

4 展望

HA 是一种极具市场开发潜力的生物产品，随着人们生活水平的提高以及人们对健康的追求，我国HA 的市场需求也随之增大，我国是水产大国，合理开发渔业资源成为渔业发展的重要课题，利用水生生物生产优质透明质酸必然成为其中重要一项。

以水生生物为原料生产的透明质酸分子量大，具有优良的吸水保水性能，为其在化妆品的应用提供了广阔的前景。但天然提取的HA 溶解速度快、吸收迅速、在组织停留时间短，这给HA 的进一步利用带来麻烦，因此对HA 的改性、降解以及在食品、医学等领域的研究成为现在和将来的研究重点。

［1］Oh E J，Park K，Kim K S，et al.Target specific and longacting delivery of protein，peptide，and nucleotide therapeutics using hyaluronic acid derivatives［J］.Journal of Controlled Release，2010，141(1):2-12.

［2］Kogan G，Šoltés L，Stern R，et al.Hyaluronic acid:a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications［J］.Biotechnology Letters，2007，29(1):17-25.

［3］Kakehi K，Kinoshita M，Yasueda S.Hyaluronic acid:separation and biological implications ［J］ .Journal of Chromatography B，2003，797(1):347-355.

［4］Meyer K，Palmer J W.The polysaccharide of the vitreous humor［J］.Journal of Biological Chemistry，1934，107 (3):629-634.

［5］鲁念慈，谭天伟.透明质酸的制备及其应用［J］.功能高分子学报，2001，14(3):370-376.

［6］Murado M A，Montemayor M I，Cabo M L，et al.Optimization of extraction and purification process of hyaluronic acid from fish eyeball［J］.Food and Bioproducts Processing，2012，90(3):491-498.

［7］沙坤.中国林蛙皮透明质酸提取技术的研究［D］.吉林:吉林农业大学，2004.

［8］孙智华，张照瑞.泥鳅粘液中透明质酸的制备及其理化性质的研究［J］.药物生物技术，2001，8(1):42-44.

［9］王大为，张艳荣，沙坤.中国林蛙皮多糖类天然保湿因子的提取与鉴定［J］.吉林农业大学学报，2002，24(6):99-102.

［10］Weissmann B，Meyer K.The Structure of Hyalobiuronic Acid and of Hyaluronic Acid from Umbilical Cord1，2［J］.Journal of the American Chemical Society，1954，76(7):1753-1757.

［11］潘红梅.透明质酸的研究现状综述［J］.四川食品与发酵，2003，39(1):5-9.

［12］Fessler J H，Fessler L I.Electron microscopic visualization of the polysaccharide hyaluronic acid［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1966，56(1):141

［13］Atkins E，Sheehan J K.Structure for hyaluronic acid［J］.Nature，1972，235(60):253-254.

［14］Liu L，Liu D，Wang M，et al.Preparation and characterization of sponge-like composites by cross-linking hyaluronic acid and carboxymethylcellulose sodium with adipic dihydrazide［J］.European polymer journal，2007，43(6):2672-2681.

［15］陈永浩.透明质酸发酵法制备及其复合改性研究［D］.无锡:江南大学，2010.

［16］崔媛，段潜，李艳辉.透明质酸的研究进展［J］.长春理工大学学报，2011，34(3):101-106.

［17］李腾飞.低分子量透明质酸超声—化学制备的基础及实验研究［D］.重庆:重庆大学，2011.

［18］Trabucchi E，Pallotta S，Morini M，et al.Low molecular weight hyaluronic acid prevents oxygen free radical damage to granulation tissue during wound healing［J］.International journal of tissue reactions，2002，24(2):65.

［19］Knoflach A，Azuma H，Magee C，et al.Immunomodulatory functions of low-molecular weight hyaluronate in an acute rat renal allograft rejection model［J］.Journal of the American Society of Nephrology，1999，10(5):1059-1066.

［20］胡星，王军，韦峰，等.小分子量透明质酸促进星形胶质细胞中脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子的表达［J］.中国组织工程研究，2012，16(28):5216-5221.

［21］Ghatak S，Misra S，Toole B P.Hyaluronan oligosaccharides inhibit anchorage - independent growth of tumor cells by suppressing the phosphoinositide 3 - kinase/Akt cell survival pathway［J］.Journal of Biological Chemistry，2002，277(41):38013-38020.

［22］Park S N，Park J C，Kim H O，et al.Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3 - dimethylaminopropyl)carbodiimide cross - linking［J］.Biomaterials，2002，23(4):1205-1212.

［23］Kim J K，Srinivasan P，Kim J H，et al.Structural and antioxidant properties of gamma irradiated hyaluronic acid［J］.Food Chemistry，2008，109(4):763-770.

［24］Miyazaki T，Yomota C，Okada S.Ultrasonic depolymerization of hyaluronic acid［J］.Polymer Degradation and Stability，2001，74(1):77-85.

［25］王菁，杨佳玉，金淼，等.鱿鱼眼透明质酸降解工艺条件研究［J］.食品科学，2009，30(24):238-241.

［26］代琼，杨文鸽，陈小芳，等，鱿鱼眼透明质酸及其降解产物的抗氧化和保湿作用［J］.食品科学，2012，33(01):35-38.

［27］卢佳芳，鱿鱼眼中透明质酸的提取、降解及其生物活性研究［D］.宁波:宁波大学，2010.

［28］张丽媛，李和生，孙楠楠，等.响应面法优化金乌贼眼透明质酸的提取工艺［J］.食品科学，2011，32(22):114-118.

［29］汪建，汪清，谢镇.酶解条件控制对透明质酸工业化提取的影响［J］.中国医药工业杂志，2010，41(1):20-23.

［30］梁天佐.微生物发酵法产透明质酸工艺研究［D］.保定:河北农业大学，2010.

［31］谢镇，汪建.鸡冠透明质酸工业化生产中质量影响因素分析［J］.中国生化药物杂志，1993(4):19-22.

［32］姚美琴，褚俊杰，陈小娥.鱿鱼眼透明质酸的提取工艺研究［J］.食品科技，2009，34(5):241-244.

［33］虞菊萍，高向东.透明质酸精制方法的比较［J］.药学与临床研究，2007，15(4):300-302.

［34］郭学平，凌沛学，王春喜，等.透明质酸的生产［J］.药物生物技术，2000，7(1):61-64.

［35］李知敏，王伯初，周菁，等.植物多糖提取液的几种脱蛋白方法的比较分析［J］.重庆大学学报:自然科学版，2004，27(8):57-59.

［36］Amagai I，Tashiro Y，Ogawa H.Improvement of the extraction procedure for hyaluronan from fish eyeball and the molecular characterization［J］.Fisheries Science，2009，75(3):805-810.

［37］刘丽.透明质酸菌株发酵条件优化、制备及应用研究［D］.北京:中国农业科学院，2010.

［38］丁霞.透明质酸的生物合成及其纯化［D］.南京:南京理工大学，2004.

［39］李润，查五一.羊眼透明质酸制备工艺的改进［J］.中国医药工业杂志，1999，30(7):289-291.

［40］倪杭生，李润，贺艳丽，等.透明质酸的离子交换层析纯化［J］.中国医药工业杂志，2001，32(11):485-488.

［41］刘骥翔，叶华，苏海佳，等.离子交换层析纯化透明质酸［J］.生物加工过程，2009，4(7):32-35.

［42］周海东，倪晋仁，黄文，等.膜技术分离透明质酸发酵液可行性研究［J］.食品与发酵工业，2006，31(11):46-51.

［43］盛瑞堂，孙猛，谭天伟.过滤法分离纯化透明质酸［J］.过程工程学报，2006，6(2):285-288.