实时荧光定量PCR 技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用

韩 齐，孔保华 ，李沛军，李暮春

(东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030)

2011 年12 月21 日起，我国正式施行由卫生部组织制定的食品安全国家标准《速冻米面制品》(GB19295-2011)。新国标中放宽了对金黄色葡萄球菌的要求，其含量由不得检出调整到可限量检出并采用三级采样法，每一批生制品抽查的5 个样品中允许有1 个样品含金黄色葡萄球菌量在1000 ～10000cfu/g 内，这批产品即为合格产品［1］。新国标的颁布引发了激烈的争论，金黄色葡萄球菌作为主要的食源性致病菌更是受到了广泛的关注。金黄色葡萄球菌不仅存在于速冻米面制品中，乳、乳制品和肉类等也通常含有金黄色葡萄球菌的肠毒性菌株［2］。金黄色葡萄球菌的检测通常采用以形态学和生物化学特征为基础的传统方法［3］。目前，国标方法［4］(GB4789.10-2010)主要采取Baird-Parker 平板和血平板相结合的传统方法对食品中金黄色葡萄球菌进行检测。这些方法虽然操作简单，但耗时长(需5d左右)、灵敏性差，会造成食品积压过程中的经济损失。因此，需要一种灵敏、高效的方法对金黄色葡萄球菌进行快速检测。近年来，实时荧光定量PCR(简称Real-time PCR)技术因具有特异性强、灵敏度高、快速和应用范围广等特点，已经成功应用于食品微生物学中并且能够替代传统培养方法来快速定量检测样本［5］。本文介绍了Real-time PCR 技术原理、分类和特点，并对Real-time PCR 技术在食品中金黄色葡萄球菌检测的研究进展与应用进行了综述。

1 Real-time PCR 技术概述

过去20 年中，独立于培养的分子生物学技术已经有很大的发展。使微生物群落整体的分析变得可行，增加了我们对其成分、动力学和活性的了解［6］。PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是诞生于1985 年的一项体外扩增DNA 的技术［7］。定量PCR 已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时荧光定量PCR(简称Real- time PCR)。实时荧光定量 PCR (Realtime Flurescent Quantitive Polymerase Chain Reaction)技术，由美国Applied Biosystems 公司于1996 年推出，可应用于食源性致病菌的特异性和定量检测，主要应用于肉、肉类产品、乳和乳制品中。

1.1 Real-time PCR 技术原理

Real-time PCR 技术原理是将荧光基团加入到PCR 反应体系中，利用PCR 指数扩增期间荧光信号的强弱变化实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，并由此分析目的基因的初始量。Ct 值是Real-time PCR 技术中很重要的一个概念。C 指Cycle 即循环数，t 指threshold 即阈值，Ct 值表示的是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时经历的循环数［8］。研究表明［6，9］，每个模板的Ct 值与起始拷贝数的对数之间存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。将已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，横坐标为起始拷贝数的对数，纵坐标为Ct 值。因此，只要知道未知样品的Ct值，就可以从标准曲线上计算出未知样品的起始拷贝数，从而达到定量分析的目的。

1.2 Real-time PCR 技术分类及其特点

Real-time PCR 技术根据检测的荧光信号可以分为两类［10］:一类是双链DNA 特异荧光染料(如SYBR GreenⅠ);另一类是特异性荧光标记探针，包括水解探针(如TaqMan 或TaqMan-MGB)和杂交探针(如分子信标)。染料法是利用染料与双链DNA 小沟结合发出的荧光信号指示增加的扩增产物;探针法则是利用能与靶序列特异性杂交的探针来指示增加的扩增产物［11］。这些方法允许不需要PCR 后处理操作的自动检测，降低了相互污染的风险。因此，与常规PCR 相比，Real-time PCR 技术不仅完成了PCR从定性到定量的飞跃，其主要优点是灵敏性高、特异性强、降低扩增规模并且不需要PCR 后处理操作，降低了相互污染的风险［12］。

荧光标记探针方法，如常用的TaqMan 探针法，对PCR 产物的检测特异性更高［13］。但是需要根据非常严格的条件选择适宜的引物和探针，这往往不易达到。而荧光染料法，如常用的SYBR Green I 染料法检测PCR 产物则打破了这种限制，不需要连接荧光分子的探针［14］。两种方法各有利弊，染料类方法的优点是:灵敏度高;通用性好、不需要设计探针、方法简便、价格低廉;可以高通量大规模的定量PCR 检测。但是只适用于专一性要求不高的定量PCR 检测。而探针类方法适用于扩增序列专一的体系检测，对特异性要求较高的定量。优点是:高适应性和可靠性，实验结果稳定重复，但当靶基因的特异性序列较短时，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。

近年来，快速核酸扩增和检测技术已经迅速取代了传统方法，实际上PCR 应用于食品中病原体的检测正日益增加。而且，Real-time PCR 提供一个灵活的检测系统，在普通条件下也能立即检测多种病原体［10］。许多Real-time PCR 方法经发展研究已经可以专门定性和定量检测食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌、沙门菌属、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺菌属和弯曲杆菌属。Real-time PCR 技术直接定量检测食品中细菌性病原体的应用需要考虑以下方面［9］:选择准确并灵敏的Real-time PCR 方法;选择高效的DNA 分离法;了解所选用方法与传统细菌平板计数法性能之间的差异。

2 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的特性

金黄色葡萄球菌于1884 年被首次发现［15］，是已知可导致食源性中毒的、菌落为球形的革兰氏阳性菌［16］。由于能够产生外毒素和其他致病因素，使其成为全球性的致病菌之一。金黄色葡萄球菌可以产生多种毒素，主要为肠毒素(Staphylococcal Enterotoxins，SEs)、剥脱毒素(Exfoliative Toxin，ETs)和中毒休克毒素(Toxicshock Syndrome Toxin，TSST-1)等。金黄色葡萄球菌引起食物中毒主要原因是肠毒素(SEs)，它是一类毒力相似、结构相关、抗原性不同的胞外蛋白质［17］。SEs 是指在动物实验(猴子)中口服投药后引起呕吐的葡萄球菌属超抗原，而其它相关毒素类则为肠毒素类似(SEI)蛋白质。目前，根据在灵长类动物中的催吐效果，已有18 类SEs 或SEI被报道［18］。根据血清抗原特异性不同，可将肠毒素分为A、B、C1、C2、C3、D、E 和F 共8 个型。其中，A 型毒素毒力最强，摄入1μg 即能引起中毒，故A 型肠毒素引起的食物中毒最常见。D 型毒力较弱，摄入25μg 才能引起中毒［19］。

金黄色葡萄球菌食物中毒(SEP)是指摄入含有一种或多种SEs 食物导致的中毒。当金黄色葡萄球菌数量上升到105～106cfu/g 时［20］，就会引起食物中毒。金黄色葡萄球菌食物中毒的一般症状是突然发生恶心、剧烈的呕吐、腹部绞痛和腹泻，发病时间为食用了污染的食品后2～8h 内［21］。其引起的食物中毒呈季节性分布，多见于春夏季;常存在于乳［22］、肉制品［23］及水产品中;此外，剩饭、凉菜及即食食品［16］中也经常被检测出含有金黄色葡萄球菌。

3 Real-time PCR 技术检测食品中金黄色葡萄球菌的进展

金黄色葡萄球菌的检测是日常食品监测项目和食物中毒调查的重要的标准。目前已经立法限量乳及乳制品、肉制品、鸡蛋制品、冰淇淋和婴儿食品等食品中的金黄色葡萄球菌含量，只允许含有极少量或不含有金黄色葡萄球菌。近年来，国内外应用Real-time PCR 技术检测食品中的金黄色葡萄球菌的研究日益增加，使得Real-time PCR 技术得到逐步的完善。

3.1 原料乳及乳制品中的应用

3.1.1 原料乳中金黄色葡萄球菌的检测 金黄色葡萄球菌是导致奶牛和其它反刍动物乳腺炎的主要原因。乳腺炎导致牛奶产量减少、动物价值降低、丢弃牛奶等直接经济损失，还产生额外的兽医和人工费用［24］。而其产生的肠毒素A 是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。Fusco 等人［25］在使用Real-time PCR 方法快速定量检测生牛奶中的金黄色葡萄球菌肠毒素基因组(egc)的研究中，同时采用TaqMan 探针和SYBR Green 染料两种方法。这两种方法对小组内70 株参照菌株的特异性都接近100%，包括目前已知的所有29 株临床和食源性金黄色葡萄球菌egc 变种菌株、4 株egc 阴性金黄色葡萄球菌菌株和37 株种族近似的相关菌株。应用于实际牛奶样品中时，与常规培养方法比较这两种PCR 方法都提供了良好的响应，100%的特异性诊断和96%～107%的相对精度。该方法由于其具有高特异性、动态检测范围较广和高灵敏度，即使是在混合和高潜在污染的生牛奶中，也可以快速高效的检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因组。

李一松等人［26］使用Real-time PCR 技术检测乳中携带sea 基因金黄色葡萄球菌的研究中采用SYBR Green I 方法，实验结果表明:该方法可以在8h 内快速、稳定地检测出乳中的金黄色葡萄球菌，并确定了人为污染的牛乳中金黄色葡萄球菌的最低检出限为83cfu/mL。Aprodu 等人［27］在分子定量检测人为或自然污染牛奶中的金黄色葡萄球菌样品前处理的研究中，讨论了Real-time PCR 技术直接定量检测食品样品中病原体时，样品处理对结果产生的影响。研究中采用了3 种不同的样品处理方法来确定牛奶中金黄色葡萄球菌的最低检出限，分别为免疫磁性分离、基质增溶和浮选法，并与传统培养方法进行了对比。结果表明，免疫磁性分离样品制备虽然使用较方便、特异性较高和快速，但不能够定量检测低量和中量(＜104CFU)的金黄色葡萄球菌;基质增溶和浮选法都允许在1～10 个细胞/mL 水平上定量检测金黄色葡萄球菌，这两种方法都比平板接种检测出更多的细菌细胞当量(BCE)。因为理论上，每个金黄色葡萄球菌细胞都可能促进如肠毒素类等有害物质的表达，所以在疫情评估中，使用一个准确和标准化样品处理的Real-time PCR 方法比传统培养基平板接种方法更接近实际情况。

3.1.2 乳制品中金黄色葡萄球菌的检测 Real-time PCR 技术不仅可以应用于乳中金黄色葡萄球菌的检测，对以乳为原料的相关制品(如冰淇淋、干酪和乳粉)等也有很好的检测效果。Hein 等人［28］在使用Real-time PCR 技术检测干酪中金黄色葡萄球菌细胞的研究中，使用两种Real-time PCR 方法通过检测靶基因耐热核酸酶(nuc)以定量检测金黄色葡萄球菌细胞。结果表明TaqMan 探针法比(6nuc 基因拷贝数/μL)比SYBR Green I 染料法(60 nuc 基因拷贝数/μL)灵敏度更高。在定量检测人为污染干酪中金黄色葡萄球菌的应用中，得到的灵敏度为1.5 ×102～6.4 ×102nuc 基因拷贝数/2g。细菌数(cfu)的对数与nuc 基因拷贝数之间的相关系数为0.979～0.998，相关性良好。因此Real-time PCR 技术可以有效地检测干酪中污染的金黄色葡萄球菌。

3.2 肉及肉类制品中的应用

肉和肉类产品被认为是金黄色葡萄球菌传染的主要传播媒介之一。因此，曾多次爆发由于肉类制品被金黄色葡萄球菌污染而引起的食物中毒［29］。徐德顺等人［30］利用Real-time PCR 技术，建立食品中金黄色葡萄球菌污染的快速敏感特异的检测方法。以市售生猪肉、鸡肉等材料为原料经金黄色葡萄球菌增菌液增菌培养后，分别使用TaqMan 探针法和传统培养方法进行平行实验并进行对比，发现在10 株相关菌株的检测中，除金黄色葡萄球菌表现很好的阳性，其余菌株均为阴性。纯菌条件时，最低检测限为44cfu/mL。同一样品重复3 次的Ct 值的变异系数均小于5%。因此Real-time PCR 技术具有操作简便快捷、特异性强和稳定性高等优点，符合食品中病源微生物检验的发展需要，值得推广和应用。Alarcón 等人［31］研究发现，在人为污染的牛肉样品中使用两种Real-time PCR 方法检测金黄色葡萄球菌的最低限量为5 × 102cfu/2g，并且SYBR Green I 染料法和TaqMan 探针法均提高了检测的灵敏度，分别将检测水平降低到10 和100 个细胞水平。结果表明SYBR-Green I 染料方法成本更低，能够灵敏、自动定量检测食品中的金黄色葡萄球菌。

3.3 其它食品中的应用

金黄色葡萄球菌是一种以群落普遍存在的病原体并且长期被认为是影响公共卫生的一个主要问题。在使用Real-time PCR 技术检测金黄色葡萄球菌时，经常与多重PCR 结合使用，同时检测多种细菌性病原体，效果更好。

3.3.1 蔬菜中的应用 Elizaquíve 等人［10］使用一种新的多重单管Real-time PCR 方法同时检测新鲜的、最小程度处理的蔬菜中的大肠杆菌O157∶H7、沙门菌属和金黄色葡萄球菌，三种被频繁调查的食物传播细菌性病原体。研究包括特异性检验，并为沙门菌属设计一种新的引物和探针。研究中同时采用SYBR Green I 染料法和TaqMan 探针法，将反应条件调整到可以同时扩增和检测β-葡萄糖苷酸酶(uidA，E.coli)基因、耐热核酸酶(nuc，Sta.aureus)基因和复制起始区(oriC，Salmonella spp.)的特异性片段。结果表明，这三种病原体的检测灵敏度为103cfu/g。因此，多重Real-time PCR 技术的开发使PCR 在食品检测中的灵敏度得到了公认，并且可以高流通量和自动化检测，有望作为食品行业快速和经济的检测方法。

3.3.2 豆制品中的应用 姚蕾［32］等人在传统发酵豆制品中三种致病菌检测的研究中，以hly A 基因(单增李斯特菌)、Cereolysin AB 基因(蜡样芽孢杆菌)和nuc 基因(金黄色葡萄球菌)为靶基因设计引物和TaqMan 探针，优化PCR 反应体系，建立同时检测金黄色葡萄球菌等三种致病菌的三重Real-time PCR体系，并且进行了特异性和敏感性实验。26 株非目标菌的检测结果均为阴性，定量检测批内和批间的变异系数均小于2%。单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最低检测限分别为3 ×103、2 ×104、2 ×104cfu/mL。表明该方法特异性强、灵敏度度高、重复性好，可以在8h 内对金黄色葡萄球菌等3 种致病菌进行同步检测。

3.4 食品加工表面金黄色葡萄球菌的检测

欧洲已经立法要求食品加工表面应该是“健康卫生并易于清洗”，食品加工表面不适当的清洗和消毒存在着潜在的食品交叉感染风险。有研究表明［33］金黄色葡萄球菌等致病菌可以在手、海绵和炊具上存在几小时甚至几天。传统的检测方法虽然使用简单，但仅限于潜伏期的24～48h，鉴于可能更早的需要结果，理想的时间是食品进入市场前。因此，需要一种快速、稳定的检测方法。Martinona 等人［34］使用Real- time PCR 方法与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)试剂结合定量检测污染的食品加工表面的活性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌的研究中采用SYBR Green 染料法定量检测加工表面的病原体数量。研究发现该方法与平板计数法的结果没有显著差异。Real-time PCR与PMA 结合方法可以用于快速检测接触过高污染食品的接触表面或监测食品加工表面的消毒效果。

4 Real-time PCR 技术的应用前景

实时荧光PCR 技术能够有效解决传统PCR 中只能终点检测的局限，并且在封闭的条件下进行反应和分析，无需电泳等PCR 后处理操作，能有效预防PCR 产物之间的相互污染。并且由于其操作简便快速、特异性强、灵敏度高、假阳性低、可定量检测、误差小、稳定性好等特点已经广泛应用于食品中微生物的检测。因此，在食源性致病菌的检测中可以代替传统方法，更加高效和快速。

Real-time PCR 技术也存在着不足，如需要设计适宜的引物和探针，否则会降低检测的特异性和灵敏度;食品基质成分会影响酶活性;技术设备要求高，荧光探针费用较高。然而，这种分子诊断技术最主要的缺陷是不能区别活性和死亡病原微生物的DNA。但使用PMA 可以解决这个问题。PMA 作为DNA 嵌入试剂，可以选择性的消除死亡细菌细胞的DNA。这种方法通常和Real-time PCR 结合使用，用来检测活性病原体，如肉类制品中的单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157 ∶H7 和弯曲杆菌属等［5］。此外，由于抗生素的滥用和生态环境的改变，通常需要同时检测多种病原微生物。因此Real-time PCR与多重PCR 结合使用，能够同时在同一反应管内检测多种致病菌，效率更高。随着分子生物学技术的发展，Real-time PCR 技术还有广泛的发展空间。进一步研究优化Real-time PCR 技术并与其它技术结合使用，必将成为金黄色葡萄球菌等食源性致病菌检测发展的重要趋势。

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