胶体金免疫层析技术在牛奶抗生素残留检测中的应用

2013-04-08杜宗绪

山西农业科学 2013年7期

杜宗绪

（潍坊职业学院，山东潍坊261031）

牛奶营养丰富，是大自然赋予人类最有益健康的食品之一，但含有抗生素残留的牛奶及其制品会严重为害饮用者的身体健康。此外，抗生素残留会影响牛奶品质，造成乳制品行业的重大经济损失，还可能被排泄造成环境污染。胶体金免疫层析技术在食品安全性检测上表现出独特的优势，在测定牛奶中抗生素残留上应用前景广阔。

1 胶体金免疫层析技术（ColloidalGold ImmunochromatographyAssay，GICA）

20世纪80—90年代，在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术的基础上发展了新型体外诊断技术胶体金免疫层析技术[1]。其原理是以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体[2]。

用胶体金免疫层析技术检测牛奶中抗生素的残留，即牛奶中的抗生素在流动过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线（T线）上的抗生素-载体蛋白偶联物的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。当样本中没有抗生素或其浓度低于试纸条检测限时，T线显色；当样本中的抗生素浓度等于或高于检测限时，T线不显色；而无论样本中是否含有抗生素，质控线（C线）都会显色，以示检测有效。

2 胶体金免疫层析技术在牛奶抗生素检测中的应用

牛奶中的抗生素主要有7类，即：β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类、大环内酯类、磺胺类和氟喹诺酮类。胶体金免疫层析技术目前已成为牛奶中抗生素残留检测广泛应用的方法，大部分牛奶抗生素已经建立了GICA测定法。

2.1 β-内酰胺类（β-lactams）

β-内酰胺类抗生素是一类化学结构中含有β-内酰胺环的抗生素，常用于奶牛等家畜的个体临床治疗，会有部分残留在牛乳中。应用胶体金免疫层析技术可检测牛奶中14种β-内酰胺类抗生素残留：青霉素G、氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素、苯唑青霉素、双氯青霉素、萘夫西林、头孢曲松、头孢喹肟、头孢哌酮、头孢噻呋、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢唑啉。研究表明，青霉素G的检测限为2～4μg/L，氨苄青霉素的检测限为3～4 μg/L，阿莫西林的检测限为3～5 μg/L，苯唑青霉素、邻氯青霉素和双氯青霉素的检测限为6～30 μg/L，头孢洛宁的检测限为 10 μg/L，头孢唑啉的检测限为 15 μg/L，头孢氨苄的检测限为20 μg/L，萘夫西林和头孢喹肟的检测限为20μg/L，头孢哌酮的检测限为40～50μg/L，头孢曲松的检测限为50 μg/L，头孢噻呋的检测限为 4～100 μg/L。检测时间为 10～15 min。

王利民[3]用胶体金免疫层析法测定牛奶中的青霉素，结果表明，当样品中青霉素质量浓度低于4 ng/mL时，在测试区（T）内会出现1条肉眼可见的紫红色条带；当样品中青霉素质量浓度高于4ng/mL时，在测试区（T）内出现浅紫红色条带，或不出现浅紫红色条带。

蒲明等[4]用β-内酰胺类和四环素类多残留二联试纸条检测牛奶中12种β-内酰胺类抗生素，结果表明，检测限为：青霉素G 2～4 μg/L，阿莫西林4～5 μg/L，氨苄青霉素 3～4 μg/L，苯唑青霉素 6～8μg/L，双氯青霉素6～8μg/L，邻氯青霉素6～8μg/L，萘夫西林20 μg/L，头孢喹肟20 μg/L，头孢曲松50 μg/L，头孢哌酮 40～50 μg/L，头孢噻呋 90～100 μg/L，头孢洛宁 10 μg/L。

冯才伟等[5]研制出检测牛奶中β-内酰胺类和三聚氰胺胶体金试纸条，结果表明，牛奶中12种β-内酰胺类抗生素检测限分别为：青霉素G 2 μg/L，阿莫西林 3 μg/L，氨苄青霉素 3 μg/L，苯唑青霉素6 μg/L，双氯青霉素 6 μg/L，邻氯青霉素 6 μg/L，萘夫西林20μg/L，头孢喹肟20μg/L，头孢曲松50μg/L，头孢哌酮40 μg/L，头孢噻呋90 μg/L，头孢洛宁10 μg/L；假阳性率低于5%，假阴性率为0，检测时间不超过15 min。

林杰等[6]用基于胶体金免疫技术的ROSA法同时快速检测新鲜牛奶中的四环素类和β-内酰胺类药物残留，结果表明，检测限为：青霉素G 3 μg/L，阿莫西林4μg/L，氨苄西林3μg/L，苯唑西林30μg/L，邻氯青霉素 30 μg/L，双氯青霉素 30 μg/L，头孢氨苄 20 μg/L，头孢唑啉 15 μg/L，头孢噻呋 4 μg/L。检测时间为10 min。

2.2 四环素类（Tetracyclines）

四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，广泛应用于多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体等所致的感染。牛奶中四环素、强力霉素、土霉素、氯四环素、金霉素5种四环素类抗生素残留均可应用胶体金免疫层析技术进行检测，其中，四环素的检测限为10～200 μg/L，土霉素的检测限为30～100 μg/L，强力霉素的检测限为40～100 μg/L，氯四环素的检测限为 80～100 μg/L，金霉素的检测限30～700 μg/L。检测时间为5～15 min。

蒲明等[4]用β-内酰胺类和四环素类多残留二联试纸条检测牛奶中4种四环素类抗生素，结果表明，检测限四环素、强力霉素、土霉素、氯四环素均为 80～100 μg/L。

张银志等[7]应用金标快速检测试纸条对食品中四环素类抗生素检测进行了研究，以四环素多克隆抗体-胶体金复合物作为分析探针，四环素完全抗原作为竞争抗原，构建分析体系，结果表明，试纸条检测四环素的检测限为200 μg/L，检测时间不超过15 min。

付云洁等[8]用胶体金免疫层析法快速检测食品中金霉素残留，采用戊二醛交联法制备金霉素-BSA免疫抗原，按照常规的免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗金霉素多克隆抗体，采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒大小为15 nm的胶体金，并制备抗体-胶体金复合物，以组装检测试纸，结果表明，金霉素的检测限为0.7 μg/mL，检测时间仅需5 min。

林杰等[6]用基于胶体金免疫技术的ROSA法同时快速检测新鲜牛奶中的四环素类和β-内酰胺类药物残留，结果表明，检测限为金霉素30 μg/L，土霉素 30 μg/L，四环素 10 μg/L。检测时间为 10 min。

汪善良等[9]用胶体金试纸条检测牛奶中残留的四环素类药物，检测限四环素、强力霉素、金霉素均为 40 μg/L，土霉素为 80 μg/L。

2.3 氨基糖苷类（Aminoglycosides）

氨基糖苷类抗生素是一类含有氨基糖苷键的抗生素，抗菌谱广，对需氧革兰阴性杆菌具有强大的抗菌活性，临床应用广泛。应用胶体金免疫层析技术可检测牛奶中新霉素残留，结果表明，新霉素的检测限为10～200 μg/L，检测时间为 3～5 min。

Jin等[10]用抗新霉素单克隆抗体链接在胶体金上的免疫层析法检测牛奶中的新霉素，结果表明，检测灵敏度为10 ng/mL，检测结果与直接竞争性ELISA相一致。

刘淑华等[11]用胶体金免疫层析法检测牛奶中新霉素的残留量，结果表明，牛奶样品无需稀释，可直接检测，牛奶中新霉素的检测限为200 μg/L，检测时间只需3～5 min；与磺胺类、四环素类、氯霉素类等药物均无交叉反应，检测结果重复性较好。

2.4 氯霉素类（Chloramphenicols）

氯霉素是一种广谱抗生素，具有良好的抗菌药理特性，被广泛应用于各类家禽、家畜、水生动物及蜜蜂中各种传染病的防治，结果表明，应用胶体金免疫层析技术可检测牛奶中氯霉素残留，检测限为1 μg/L，检测时间为 10～15 min。

王玮等[12]制备了平均粒径为20 nm的胶体金，用来标记抗氯霉素多克隆抗体，将氯霉素半抗原与卵清蛋白的偶联物包被在硝酸纤维素膜上作为检测带，羊抗兔二抗作为质控带，依据免疫竞争法原理，建立通过免疫胶体金渗滤式试纸条检测牛乳中氯霉素残留的方法，结果表明，样品前处理方法简便，检出限为1μg/L，10～15min即可目测判断结果。

王玉金等[13]建立了一种胶体金免疫层析法，可快速、简易地检测样品中氯霉素的残留含量。首先，把抗氯霉素单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，同时将人工合成的氯霉素抗原包被在硝酸-醋酸纤维素薄膜表面上，作为检测线（T线），其与待测样品中氯霉素竞争结合胶体金标记的氯霉素单克隆抗体，并能以颜色直观显示检测的结果。用GICA测定60份牛奶样品，结果表明，其中，阳性20份，阴性40份，试纸条以1 ng/mL为判断限值，没有出现假阳性及假阴性。

2.5 大环内酯类（Macrolides）

大环内酯类抗生素多为碱性亲脂性化合物，对革兰氏阳性菌及支原体抑制活性较高。应用胶体金免疫层析技术可检测牛奶中泰乐菌素和替米考星等大环内酯类抗生素残留，结果表明，泰乐菌素检测限为25 μg/L，替米考星的检测限为50 μg/L，检测时间为10 min。

罗晓琴等[14]以泰乐菌素单克隆抗体为基础，经人工制备替米考星-卵清蛋白偶联物和泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物，应用竞争抑制免疫层析原理，研制出泰乐菌素和替米考星胶体金试纸条，同时检测牛奶中的泰乐菌素和替米考星，结果表明，牛奶中泰乐菌素和替米考星的检测限分别为25，50 μg/L；假阳性率低于5%，假阴性率为0，检测时间为10 min，与其他大环内酯类抗生素无交叉反应。

2.6 磺胺类（Sulfonamides）

磺胺类抗生素能抑制革兰氏阳性菌及一些阴性菌，可治疗多种细菌感染，在兽医临床上广泛应用于治疗由敏感细菌感染的各种畜禽疾病。应用胶体金免疫层析技术可检测牛奶中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺苯酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛12种磺胺类抗生素的残留，结果表明，磺胺二甲基嘧啶的检测限为1～20 μg/L，磺胺异噁唑的检测限为10 μg/L，磺胺氯哒嗪和磺胺对甲氧嘧啶的检测限为30 μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺苯酰的检测限为50 μg/L，磺胺嘧啶的检测限为10～60 μg/L，磺胺甲氧哒嗪和磺胺多辛的检测限为70 μg/L，磺胺喹噁啉和磺胺甲噁唑的检测限为80 μg/L。检测时间为10～15 min。

张佳宜等[15]采用柠檬酸三钠法制备40 nm胶体金，电镜鉴定后标记磺胺二甲嘧啶多克隆抗体，磺胺二甲嘧啶半抗原-OVA和羊抗兔二抗分别包被在硝酸纤维素膜上，金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上，制成免疫层析快速检测试纸条，结果表明，牛奶中的磺胺二甲基嘧啶残留检出限为1 μg/L，可在10 min内完成检测。

王喜亮等[16]用胶体金标记磺胺嘧啶单克隆抗体作为显色剂，磺胺嘧啶竞争物包被于硝酸纤维素层析膜上作为捕获试剂，采用竞争反应模式制成胶体金免疫层析试纸，结果表明，该免疫层析试纸可以在15 min内完成对牛奶中磺胺嘧啶残留的半定量检测，读条系统判定灵敏度为5 ng/mL，肉眼判定灵敏度为10 ng/mL。

李海龙等[17]用胶体金免疫层析法测定牛奶中的磺胺类药物，结果表明，检测限为：磺胺嘧啶60μg/L，磺胺二甲基嘧啶20 μg/L，磺胺喹噁啉80 μg/L，磺胺氯哒嗪30 μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶50 μg/L，磺胺间甲氧嘧啶 50 μg/L，磺胺甲噁唑 80 μg/L，磺胺苯酰 50 μg/L，磺胺对甲氧嘧啶 30 μg/L，磺胺异噁唑10μg/L，磺胺甲氧哒嗪70μg/L，磺胺多辛70μg/L，假阳性率为2%，假阴性率为0。

2.7 氟喹诺酮类（Fluoroquinolones）

氟喹诺酮类药物是第3代喹诺酮类药物，具有高效、广谱、低毒等特点，在畜牧养殖业中广泛应用于预防与治疗动物疾病。应用胶体金免疫层析技术可检测牛奶中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星、依诺沙星、恶喹酸11种氟喹诺酮类抗生素残留，结果表明，恩诺沙星和环丙沙星的检测限为20～50 μg/L，沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氟甲喹和达氟沙星的检测限均为20 μg/L，依诺沙星和恶喹酸的检测限为 40 μg/L。检测时间为5～10 min。

魏东等[18]以沙拉沙星（SALX）多克隆抗体与胶体金结合为金标抗体，将纯化好的金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上，包被抗原SALX-OVA和山羊抗兔二抗分别包被在硝酸纤维素膜上，制成免疫层析快速检测试纸条，结果表明，可同时检测牛奶中的沙拉沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星残留，试纸条的灵敏度为30 ng/mL，检测时间为5～10 min。

何丹婷等[19]应用胶体金免疫层析技术建立了恩诺沙星和环丙沙星快速检测试纸，结果表明，对牛奶样本的检测限为50 μg/L，能够特异性地检测恩诺沙星和环丙沙星。

万宇平等[20]用胶体金标记的抗氟喹诺酮类单克隆抗体制备了氟喹诺酮类胶体金免疫检测试纸条，用于牛奶中11种氟喹诺酮类药物残留的检测，结果表明，对牛奶中恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星的检测限为20 μg/L，对依诺沙星、恶喹酸的检测限为40 μg/L。检测时间为5 min。试纸条的检测结果与仪器检测结果一致，重复性较好，在4℃条件下可以保存12个月。

3 展望

牛奶是健康饮食中不可或缺的食物，人类可以从中获取能量、优质蛋白、矿物质及维生素等营养物质[21]。近年来，抗菌药物被越来越广泛地用于牛奶生产，如广谱的氟喹诺酮类，高效、价廉的青霉素被广泛用于奶牛疾病和乳房炎的防治[22]；四环素、恩诺沙星等药物用于治疗奶牛多杀性巴氏杆菌病[23]，因此，牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视[24]。为加强牛奶安全监管提供强有力的技术保障[25]，胶体金免疫层析技术近年来得到广泛应用。胶体金免疫层析技术不仅操作简便、快速、特异，而且特别适用于广大基层检验人员的现场检测。由于样品成分复杂，容易影响抗原抗体反应和胶体金颗粒与蛋白质的吸附，检测结果常出现假阳性[26]。因此，胶体金免疫层析技术在未来还需向几方面发展。

3.1 提高检测灵敏度

从胶体金免疫层析技术在牛奶抗生素检测的应用结果可以看出，牛奶中抗生素残留的检测限为1～700 μg/L，检测限范围较大。因此，胶体金免疫层析技术在未来应提高检测灵敏度。

3.2 扩大检测范围

胶体金免疫层析技术至今已应用于14种β-内酰胺类抗生素，5种四环素类抗生素，1种氨基糖苷类抗生素，1种氯霉素类抗生素，2种大环内酯类抗生素，12种磺胺类抗生素，11种氟喹诺酮类药物的检测。牛奶中使用的抗生素种类繁多，因此，胶体金免疫层析技术应扩大抗生素残留检测范围。

3.3 实现多元检测

目前，胶体金免疫层析技术可同时检测鲜奶中的四环素类和β-内酰胺类药物残留[8]、牛奶中泰乐菌素和替米考星[14]和牛奶中的沙拉沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留[18]。牛奶中使用的抗生素种类繁多，不仅增加了药物残留的几率，也加大了检测的难度。因此，应开发出同时检测多种药物的试纸条，大大节省检测时间及成本。

3.4 实现定量检测

现在，胶体金免疫层析技术都是通过颜色判断结果，很容易导致高的假阳性和假阴性几率，结果也无法准确定量。用免疫层析试纸可以在15 min内完成对牛奶中磺胺嘧啶残留的半定量检测[16]。因此，应研究胶体金免疫层析技术，实现定量检测。

综上所述，随着科学技术的发展，胶体金免疫层析技术不仅发展潜力巨大，而且市场和应用前景广阔。在未来的牛奶抗生素残留检测中，胶体金免疫层析技术将会成为重要的技术手段，并将引起世界各国的广泛重视。

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