自身抗体检测的临床应用与质量控制

万本愿，李胜远，姜青龙综述

(江西省临床检验中心，江西南昌330006)

自身抗体检测的临床应用与质量控制

万本愿，李胜远，姜青龙综述

(江西省临床检验中心，江西南昌330006)

自身免疫性疾病(AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。检测项目包括：抗核抗体(ANA)、抗可提取性核抗原抗体(ENA)、抗嗜中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)等近百种自身抗体。检测方法主要有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法等多种方法。试验场所与试验过程中的显微镜、酶标仪、试剂盒、质控品等均应符合要求，人员应按标准操作程序操作,并做好自身抗体的全面质量控制。

自身免疫性疾病；质量控制

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。自身抗体的存在与自身免疫性疾病并非两个等同的概念，自身抗体可存在于无自身免疫性疾病的正常人，特别是老年人，如抗甲状腺球蛋白、甲状腺上皮细胞、胃壁细胞、单链-DNA抗体等。近年来，自身抗体检测在诊断自身免疫性疾病、判断疾病的活动程度、观察治疗效果、指导临床用药等具有重要的作用。由于不同实验室可能采用不同的抗原基质，即使同样的抗原基质，其抗原固定方法也有差异或不同。另外，由于不同的血清稀释方法以及操作者对不同荧光模式的识别能力的不同，均可影响到自身抗体的检测质量。

1 常见自身抗体检测的临床应用

大多数自身免疫性疾病患者的血清中可检测到高效价的自身抗体，虽然有些自身抗体在疾病中的作用尚未被证实，但其与疾病的相关性已获得认可。特别是有些自身抗体的检测已纳入到某些自身免疫性疾病的诊断标准中，这些自身抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断及愈后评估具有重要的临床意义。随着对自身抗体的了解越来越深入，临床应用越来越广泛，免疫学技术进一步的提高，自身抗体检测已是临床免疫检测的一项重要的实验室指标。在诊断自身免疫性疾病、判断疾病的活动程度、观察治疗效果、指导临床用药等具有重要的临床意义。笔者简单介绍一下自身抗体的临床应用。

1.1 抗核抗体(antinuclearantibody，ANA)是一组针对自身真核细胞的各种细胞核成分为靶抗原的自身抗体的总称。ANA的性质主要是IgG、也有IgM、IgA和IgD。其无器官和种属的特异性，故该类抗体可与所有动物的细胞核发生反应[1,2]。现已证实ANA对很多自身免疫性疾病有诊断价值，在不同疾病中，特别是在风湿性疾病中，其抗体谱有一定的特征性。此外，在桥本甲状腺炎、重症肌无力、多发性动脉炎等患者中也可能检测出ANA。ANA阳性已被美国风湿病学会列位SLE的诊断标准之一。

1.2 抗双链DNA抗体(double-strandedDNA，ds-DNA)抗体与细胞核的反应位点是位于DNA(外围区)脱氧核糖磷酸框架上，又称为天然DNA抗体,其靶抗原为双螺旋DNA.对诊断SLE有较高的特异性，是SLE患者的特征性标志抗体。30%-90%的活动期SLE患者此抗体阳性。且抗体滴度的消长与SLE的活动程度相关。随着疾病活动的控制，抗ds-DNA抗体滴度可以下降或消失，可作为治疗监测和预后评价的指标。抗ds-DNA抗体与DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或抗ds-DNA抗体直接作用于肾小球抗原造成SLE患者的肾损害。抗ds-DNA抗体阳性的患者较阴性患者发生肾炎的危险性高12倍[3]。

1.3 抗单链DNA(singlestrand-DNA,ss-DNA)抗体又称为变性DNA抗体,其靶抗原为核糖或脱氧核糖。在SLE患者有较高的检出率(50%～60%)，但结果缺乏疾病特异性，在其他风湿病如混合性结缔组织病，药物诱导的狼疮，硬皮病，皮肌炎，干燥综合征，类风湿性关节炎等也有10%～70%的检出率，有些正常老年人也存在[4]。

1.4 抗可提取性核抗原抗体(Anti extractable nucle-

arantigen antibody，ENA)此类抗蛋白可以溶于盐水而被提取，故称为可提取性核抗原。ENA是可提取核抗原的总称，ENA属非组蛋白的核蛋白，属酸性蛋白抗原，是由许多小分子RNA(约100~215个核苷酸)与各自对应的特定蛋白质组成的核糖核蛋白颗粒(RNP)，该组成使其各自的抗原性得以增强，分子中不含DNA。主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scl-70抗原，不同的自身免疫性疾病可产生不同的抗ENA抗体。对弥漫性结缔组织病的诊断尤为重要，但与疾病的严重程度及其活动度无明显关系[5]。

1.5 抗嗜中性粒细胞胞浆抗体(anti neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是一组以人嗜中性粒细胞胞浆成分为靶抗原的抗体，ANCA是系统性血管炎的血清标志性抗体。ANCA有两种类型:一种是细胞质型(cytoplasmic ANCA，c-ANCA)；目前认为它即是嗜中性粒细胞嗜天青颗粒内的，称之为蛋白酶3(porteinase3)的中性蛋白酶；一种是核周型(perinuclear ANCA，p-ANCA)，p-ANCA的靶抗原比较复杂，主要有髓过氧化酶(MPO)、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、溶菌酶和乳铁蛋白等。与临床多种小血管炎性疾病密切相关，c-ANCA阳性最主要见于Wegener肉芽肿以及全身性血管炎，特异性＞97%，敏感性在初发非活动期患者为50%，活动期患者可达100%。p-ANCA多见于显微镜下多血管炎、变态反应性肉芽肿性脉管炎、坏死性新月体型肾小球肾炎[6]。

1.6 类风湿因子(rheumatoid factor,RF)是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体，无种族特异性。与RA高度相关，70～90%的RA患者为RF阳性，是类风湿性关节炎诊断标准之一。但RF阴性不能排除RA的诊断。除RF外，还有很多疾病RF阳性，如干燥综合症，混合性结缔组织病，2型混合性冷球蛋白血症，慢性活动性肝炎，亚急性戏剧性心内膜炎，全身性红斑狼疮，多种细菌、真菌、螺旋体、寄生虫、病毒感染。因此，RF阳性时应结合临床全面检查，对其临床意义作出综合分析[7,8]。

1.7 抗角蛋白抗体(antikeratin antibody,AKA)又称为抗丝集蛋白抗体(anti-filaggrin antibody,AFA)或抗角质层抗体(anti corneum antibody,ASCA),AKA主要见于类风湿性关节炎患者。在非类风湿性关节炎的自身免疫病患者AKA的阳性检出率极低。AKA与RF在诊断RA时具有显著的相关性[10]。

1.8 抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody，CCP)研究发现丝集蛋白中的瓜氨酸是抗原性表位的主要成分，用合成的环化瓜氨酸多肽(CCP)作为抗原基质检测。抗环瓜氨酸肽抗体的检测，是用于风湿性关节炎(RA)早期诊断的一个高度特异的新指标，敏感性为50～78%，特异性为96%，早期患者阳性率可达80%[11,12]。

1.9 抗肝抗原自身抗体有多种，包括抗肝特异性脂蛋白(LSP)抗体、抗肝细胞膜抗原(LMA)抗体、抗线粒体抗体(AMA)、抗肝肾微粒体(LKM)抗体、抗平滑肌抗体(ASMA)和抗可溶性肝抗原和肝胰抗原(SLA/LP)抗体等。这些自身抗体在区分病毒性肝炎及自身免疫学肝炎(AIH)分型中具有重要的临床意义[13-15]。

1.10 抗胰岛细胞抗体(anti islet cell antibody,ICA)是胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM)患者中最常见的自身抗体。新确诊的IDDM患者其APICA的阳性检出率可达90%以上。通常在治疗一年后该抗体水平下降[16]。

2 自身抗体的检测方法

2.1 间接免疫荧光法(indirect immunofluorescent method,IIF)是一种作为总的ANA筛选的经典试验，IIF检测在过去最常用小鼠肝细胞印片作为抗原底物片，目前最常用的是核质丰富的培养细胞—Hep-2细胞作为抗原。培养Hep-2细胞作为底物固定于载玻片上，与受检血清反应，血清中ANA与核抗原结合，形成抗原-抗体复合物，此时再加入FITC标记的抗人IgG，标记抗人IgG与抗原-抗体复合物结合形成标记抗体-抗原-抗体复合物，在荧光显微镜下可观察到底物片上ANA荧光着染强度和免疫荧光图形。

2.2 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA)酶免疫测定是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合，发展建立的一种非放射性标记免疫分析方法。由于ELISA具有灵敏度高、特异性强，酶免疫试剂的性质比较稳定，操作方法简便快速、无放射性污染以及应用范围广等很多优点，是目前应用最为广泛的一项免疫学实验。由于纯化的或重组的抗原生产技术的成熟，商品化用于自身抗体检测的高质量的试剂盒已日渐增多，该法检测自身抗体快速、敏感性及特异性强。由于该检测方法的灵敏度高、特异性强、可量化且排除了人为的主观判断，费用低廉，是目前国外大多数自身免疫诊断检测实验

室的首选检测方法。

2.3 免疫印迹法(Western-blot,WB)是属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。其基本原理是将从小牛或兔胸腔提取的ENA抗原，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，按分子量大小分离成区带，经参照对应分子量标准物质确定每一抗原区带的分子量。然后将各抗原区带转印至硝酸纤维膜上制成抗原吸附载体膜。将待检血清加在已切成细条的硝酸纤维膜上，待检血清中存在的抗ENA抗体分别与硝酸纤维膜上的相应抗原区带结合，当再加入酶标记抗人IgG抗体后形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物，再加入酶的底物，出现显色反应，参照此时抗原区带的分子量及各区带的相对位置，可辩读出各特异性抗ENA抗体。主要用于ANA阳性患者对单一抗原成分特异性自身抗体的确诊分析[17]。

2.4 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性物质标记的抗体对待检样品中抗原成分进行测定的方法。

2.5 免疫斑点法(Immunodot assay,IDA)这是免疫印迹法的一种改进的方法。将多种亲和层析纯化的、生化性质明确的核抗原平行包被到膜条上作为固相，可用于抗ENA抗体的检测[18]。

3 自身抗体检测的质量控制

自身抗体检测的质量控制(QuanlityControl,QC)是保证实验结果准确性的重要环节，同时也是衡量实验室检测水平的一个重要指标。由于自身抗体检测多为定性实验或半定量实验(以滴度报告)，特别强调每次实验中应同时设置检测阳性对照，阴性对照，以监测结果的准确性。同时，也便于对实验室内部、实验室之间质量控制的可比性、重复性进行评估。

3.1 自身抗体检测的器材的要求(1)实验室应有充分的空间、良好的照明和空调设备；设施和设备配备合理，能满足自身抗体检测的要求。(2)微量加样器必须定期进行校准，从而使其保持有足够的准确度和精密度。(3)荧光显微镜的质量和荧光光源的强度是保证良好分辨率的基础。(4)酶标仪应定期校准，制定标准操作程序和严格的维护保养措施。(5)检测用试剂盒必须由具有相关资质的厂家提供，并按规定保存。(6)每家开展检测的实验室都应对厂家推荐的荧光标记物的稀释方法进行评价，应用已知滴度的阳性血清去滴定标记物，以建立操作过程中的正确稀释方法。(7)质控品应与患者标本在同样条件下进行测定，并要特别注意质控品的保存条件和保质期，不得使用保存不当和超过保质期的质控品。(8)每家开展检测的实验室都应建立其自身抗体检测项目的标准操作规程文件。(9)相对固定检测人员，并严格按照SOP文件要求进行检测。阳性结果最好与该患者过去检测档案进行复核后再发出结果。(10)开展自身抗体检测的实验室在保证室内质控的同时，应参加国家或国际权威组织的室间质量评价。

3.2 实验基质的选择要求

3.2.1 实验基质的选择实验基质的质量在很大程度上取决于间接免疫荧光法对自身抗体进行测定的效果。自身抗体检测中的实验基质，一般用动物或人类的细胞或组织，须经一系列方法进行处理，如HEP-2细胞的培养、吸附和固定，冰冻组织切片的制备、贴片等。越来越多的实验室已经使用商品化的自身抗体间接免疫荧光检测试剂盒。由于生产工艺先进，质控措施严格，从而保证了实验结果准确的可信性。检测不同的自身抗体应选择不同来源的实验基质，如检测ANA一般用人上皮HEP-2细胞和灵长类动物肝脏。而器官和组织特异性自身抗体则选用相应的抗原器官组织。

3.2.2 荧光标记二抗的选择在自身抗体检测中，荧光标记二抗的质量直接影响实验的结果。荧光素与第二抗体的偶联需要保持一定的摩尔比值(F/ P,荧光素/抗体蛋白比值)，F/P值过高将产生明显的非特异性荧光。

3.3 结果的判断和解释

3.3.1 结果的判断实验条件及检测试剂盒在规定条件下，待检血清在合适的起始稀释度下，实验基质没有可辨认的荧光染色模式时，即与阴性对照比较在同一水平，判为阴性；实验基质产生可辨认的特异性荧光染色模式时，即可于阳性对照比较在同一水平或高于阳性对照的水平，判为阳性。通过自身抗体效价与滴度消长，可判断疾病的活动性，观察治疗反应，指导临床治疗。检验报告中必须描述每个图型及其滴度；有的图型与疾病有相关性，也可提示做特异性免疫检测。

3.3.2 结果解释应结合相应的荧光模式、自身抗体水平、患者年龄等几方面进行综合分析。正常老年人，尤其是女性可出现低滴度的自身抗体(1:80)；相反,年龄较小的患者当其滴度在1:40时也应进一步筛查(尤其是女性患者)；但一些无症状患者也可出现自身抗体的低滴度阳性。因此，有些自身抗

体检测的结果必须根据患者的临床表现进行分析[19]。如遇到图型不典型、意义不明确，也应在检验报告中有注解，以便临床医师知晓；检验报告应由资深人员出具；各实验室应建立自己的参考区间。

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A

1674-1129(2013)01-0052-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.018

万本愿，男，1954年生，本科，主任技师，主要研究方向为临床化学、分子生物学及实验室质量管理。