Nutlins在肿瘤治疗中的作用机制及其研究进展

王莉综述，邬黎青审校

Nutlins在肿瘤治疗中的作用机制及其研究进展

王莉1综述，邬黎青2审校

(1、南昌大学医学院,江西南昌330006；2、南昌大学第二附属医院，江西南昌330006)

肿瘤应答化疗的机制包括凋亡、有丝分裂死亡及老化。肿瘤化疗存在的最大问题之一是化疗停止后肿瘤复发，而静止期肿瘤细胞逃避肿瘤应答化疗的机制又是导致肿瘤复发的重要原因之一。Nutlins是近几年发现的MDM2的小分子拮抗剂，能结合到MDM2与p53的结合位点，阻止MDM2与p53的结合，稳定内源性野生型p53并激活p53通路，抑制细胞生长，引起细胞凋亡或细胞周期阻滞(包括老化和静止)。最近研究发现Nutlin-3亦能阻止MDM2与p73α的结合，增加内源性p73α的转录活性，p73α可激活p53应答基因而抑制细胞生长，引起细胞凋亡。总之，Nutlin-3可同时激活p53及p73α，使其成为抗癌药物具有极大潜能。本文旨在对Nutlins在肿瘤治疗中的作用机制及研究进展作一文献综述。

Nutlins；p73；p53；MDM2；肿瘤治疗

随着对肿瘤细胞生长、增殖、凋亡的分子机制研究的深入，使人类靶向性治疗肿瘤成为可能。p53肿瘤抑制蛋白通过诱导细胞凋亡或细胞周期停滞对细胞应激做出反应，从而控制细胞命运。MDM2是一种E3泛激素连接酶和一种核磷酸化蛋白，能够诱导p53的出核转运、促进泛素化以及蛋白质的降解[1]。一组能起到化学治疗作用的Nutlins分子，能阻止p53与MDM2之间的相互作用，同时也能抑制凋亡蛋白P73同种型TAp73α与无效的p53-MDM2细胞之间的内源性结合[2]，导致细胞周期阻滞或细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。Nutlin-3能在细胞中以p53依赖途径和非p53依赖途径诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,并为这一药物在肿瘤治疗中合理有效地利用提供了一个基础[3]。总之，不管p53基因处于何种状态，Nutlin-3都有显著地抗肿瘤细胞的作用，这表明它给人类肿瘤的治疗带来了希望[4]。对此，本文从以下几个方面进行分析。

1 p53基因、p73基因、MDM2基因的结构、功能及作用特点

1.1 p53基因的结构、功能及作用特点人类p53基因定位于17P13.1，全长16~20 kb,由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8分别编码5个进化上高度保守的结构域，即第13～19、117～142、171～192、236～258、270～286编码区。P53基因转录成2.5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为53KD。野生型P53蛋白可分为三个区域：第一区域定位于1295AA的酸性氨基末端,含转录激活结构域和生

长抑制结构域,此区也是p53与MDM2、p14ARF和p300结合的区域;第二个区域是1022292AA的中央核心区，能与特异性识别的DNA序列结合,p53的5个保守区(BoxI2Ⅴ)有4个位于此区,这4个保守序列是此区功能执行的重要结构。第三区域为3002393AA的碱性羧基末端,含四聚体寡聚化结构域、非特异DNA结合区域及3个核定位信号和1个核输出信号。核定位信号介导P53蛋白定位于胞核内,核输出信号则介导P53蛋白从胞核穿梭入胞质。正常的P53蛋白在DNA损伤或缺氧时活化，使依赖p53的CDK抑制物p21和DNA修复基因上调性转录，细胞在G1期出现生长停滞，进行DNA修复。如修复成功，细胞进入S期；如修复失败，则进入凋亡，以保证基因组的遗传稳定。

1.2 p73基因的结构、功能及作用特点人类p 73基因定位于人染色体1p36.21-p36.3，由13个外显子和12个内含子组成,具有5个同源异构体,分别α、β、γ、δ和ε。其中p73α是全长mRNA形式,而β缺少外显子13,γ缺少外显子11,δ为缺少11、12、13的剪切异构体。P73蛋白有四个区域，即N端转录激活区、核心DNA结合区、C端寡聚体化区和C端非特异结合区，分别与P53的4个氨基酸序列有29%、63%、38%和33%的同源性。p73中存在与p53-MDM2相似的结合区,并且与MDM2和MDMX的结合比p53更加稳定。以上特点表明,p73与p53在靶DNA结合方面具有高度同源性;p73和p53的转录激活功能相似;但p73和p53可能存在不同的调控方式。

1.3 MDM2基因的结构、功能及作用特点人类MDM2基因的cDNA起始密码开始于第312位核苷酸，开放读框从5端到第1784位核苷酸，第181～185、305～322位密码子分别为核定位信号和酸性活化域。在MDM2基因内存在两个启动子p1和p2，p1在编码基因的上游，可组成性地表达，p2位于第一个内含子中，p53通过p2启动子附近的2个p53结合位点调节MDM2的转录。MDM2蛋白具有四个功能区：第一区域包括N端约100个氨基酸残基，是MDM2、p53、p73基因相互结合的部位，以直接结合到基因启动子上，激活基因转录；第二区域为高区域，能与核糖体15蛋白及5sr-RNA结合；第三区域含有一个锌指结构，具有转录因子的活性，促进细胞由G0期进入S期；第四区域含有一个环指结构，可介导蛋白质之间的相互作用，也能结合DNA或RNA，参与细胞周期调控，促进细胞增殖[5]。

2 p53、p73、MDM2之间的作用机制

p53基因包括转录活性区域、富含脯氨酸的N端区域、DNA结合位点以及在C端的一个四聚化区和一个调节区。p53基因是一个在多种应激条件下激活的转录因子，而P53蛋白则转录调节多种基因的表达，发挥不同的生物学作用。p73中存在与p53-MDM2相似的结合区,并且与MDM2和MDMX的结合比p53更加稳定。Momand等通过免疫沉淀首先证实了MDM2与p53之间的相互作用，并发现了两者之间的作用位点。通过对p53基因敲除和突变的研究，发现MDM2结合在P53蛋白N端的转录活性区域；对P53蛋白N端的11个氨基酸和MDM2蛋白N端109个氨基酸片段的复合物进行晶体X线衍射研究，发现MDM2、p53二者之间主要以疏水作用结合，结合界面的表面积为14.98nm。p53疏水面与MDM2螺旋结合，MDM2疏水裂隙界面上排列有14个芳香性和疏水性氨基酸，另一侧与MDM2折叠接近，使Phe、Trp和Leu嵌入到MDM2疏水裂隙中，结合界面另有两处分子间以氢键相连。在上述结构基础上，MDM2通过介导P53蛋白降解和抑制p53转录活性来调节p53的功能。生理情况下，MDM2和p53在细胞内的表达维持在一个较低水平。MDM2通过促进p53核输出而导致其降解，使其在细胞中保持较低水平，或使其处于无活性状态。研究表明，MDM2与p53之间存在着一个自动调节的负反馈环[6]，下调了抑癌基因p53的活性。总之，这种负反馈环既调节了P53蛋白活性，又调节了MDM2基因表达。

当DNA受到损伤时，细胞内的p53水平则会升高，在G1期末限制点阻滞细胞周期进展；与此同时，p53也激活了MDM2基因转录，增强了MDM2蛋白表达。MDM2蛋白特异性地结合到p53上，抑制p53转录功能，促进p53向核外转运，并作为E3泛素连接酶使P53蛋白经泛素化途径降解，使之不可逆地失活。这种双向调节机制维持了细胞对于应激反应的平衡。MDM2过表达可以封闭p53介导的反式激活作用，使p53功能丧失，染色体不稳定性增加,细胞周期进展，显示出癌蛋白的活性，参与肿瘤的形成[7]。

当MDM2过度表达时，MDM2蛋白还会结合p53家族的其他成员：p63和p73基因。像p53与

MDM2的相互作用一样，p73和MDM2在p73基因转录活性中也有相似的效果。p73也会与MDM2 N末端的疏水基团结合形成p73-MDM2，从而降低p73的浓度及抑制其转录活性。

3 Nutlins的结构、功能及作用机制

Nutlins为顺式咪唑啉类似物，是最先发现的一类MDM2选择性小分子抑制剂。Nutlins包括Nutlin-1、Nutlin-2、Nutlin-3，Nutlin-3有两种异构体，即Nutlin-3a和Nutlin-3b，其中Nutlin-3a的活性要比Nutlin-3b大150倍之多。当Nutlins在IC50为100至300μM的浓度范围内，他们可结合在p53与MDM2的袋状位点上，通过打乱p53与MDM2的结合从而稳定和激活p53。Nutlins作为MDM2的小分子抑制剂，高度模拟p53肽段的作用，其咪唑啉结构代替了p53肽段主链，精确地占据了MDM2蛋白上p53结合位点，干扰了MDM2、p53之间的相互作用，使p53持续发挥活性，从而阻滞细胞周期进展，促进细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。体内外研究发现，在野生型p53基因的肿瘤细胞中，Nutlins通过干扰MDM2、p53的相互作用而发挥作用[8-11]。而在p53失活的细胞内，Nutlins通过干扰MDM2、p73之间的相互作用，增强p73的转录活性，促进细胞凋亡[12]。

4 Nutlins与肿瘤治疗

众所周知Nutlins之前已被证明可有效对抗多种含有野生型p53的肿瘤细胞，包括神经母细胞瘤,视网膜母细胞瘤、骨肉瘤，以及白血病。传统的化疗药物及研究表明，其对突变型p53、失活型p53以及缺失型p53的肿瘤细胞是无效的。然而，近几年的研究结果表明，不管p53基因处于何种状态，Nutlins对人类肿瘤的治疗效果都是十分明显的，这一点主要体现在以下几个方面。

4.1 肝细胞癌Jiabei Wang等人运用细胞活性测定，细胞周期分析，细胞凋亡检测，免疫印迹，免疫共沉淀和siRNA的实验方法分析了野生型p53，突变型p53和空白型p53三组人类肝癌细胞，对肝癌细胞株中Nutlin-3靶向作用于p53和p73通路进行评估。实验表明Nutlin-3通过诱导G0/G1期阻滞和细胞凋亡的独特结合，不仅上调了p53基因在肝癌细胞的表达，还上调了p73基因在Huh7和hep3B细胞的表达，同时干扰肝癌细胞中的p53-MDM2和p73-MDM2复合物生成，发挥了最大的抗肿瘤效应[13]。如果这种机制能在体内得到证实，MDM2的选择性拮抗剂Nutlin-3可以为不同类型的p53肝细胞性肝癌患者治疗提供一种新型的治疗方法。此外，Tongsen Zhen等人首次评价了Nutlin-3与阿霉素联合治疗的对肝癌生长和细胞凋亡的效果。为了明确阿霉素和Nutlin-3对细胞生长的影响，他们用浓度递增的阿霉素(其中有些加Nutlin-3有些未加Nutlin-3)对四个肝癌细胞系(Hep3B，SK-Hep-1，HepG2，Huh-7)进行处理，48h后用CCK-8试剂盒评估肿瘤细胞生长情况。实验表明Nutlin-3提高了阿霉素抑制细胞生长的作用，并主导了不同类型的p53肝癌细胞系的细胞凋亡作用。Nutlin-3使结合在HepG2上的p53-MDM2和结合在Huh-7及Hep3B上的p73-MDM2分解，激活了细胞凋亡通路，提高了肝癌细胞对阿霉素化疗的敏感性，从而发挥明显的抗肿瘤效应。总之，Nutlin-3明显增强了阿霉素对肝癌细胞生长的抑制作用，Nutlin-3和阿霉素联合治疗具有协同效应[14]。从中我们可以得知，Nutlin-3将在肝细胞癌治疗中越来越活跃，并为攻克阿霉素耐药性带来了新的研究前景。

4.2 套细胞淋巴瘤Yoko Tabe[15]等人为了明确Nutlin-3能否有效的激活TP53，在套细胞淋巴瘤中诱导细胞死亡是否有效。他们用Nutlin-3对已知TP53状态的套细胞淋巴瘤细胞系进行处理，对其生物和生化结果进行分析，并对标准基因毒性代表阿霉素与新型蛋白酶抑制剂硼替佐米的协同作用进行了评估。他们的实验表明，Nutlin-3的IC50＜10Amol/L时，在野生型TP53Z-138和Granta 519细胞中，将导致细胞增殖或生存能力减弱，而凋亡部分加强以及细胞周期停滞。这些效应伴随着TP53的积累和TP53相关蛋白p21、MDM2、Puma和Noxa的诱导。这表明Nutlin-3与阿霉素或硼替佐米在野生型TP53套细胞淋巴瘤中的联合是可以相互增效的。Nutlin-3为22.5 Amol/L显著高于IC50的情况下，在突变的TP53-MINO细胞中，Nutlin-3也能诱导细胞周期阻滞和消减细胞的生存能力。而这些效应与TP53同族体p73的诱导，p21和Noxa的增加、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化有关。这表明，Nutlin-3和硼替佐米协同作用，抑制了MINO细胞的生长。由此可知，Nutlin-3能在套细胞淋巴瘤细胞系中以TP53依赖方式和非TP53依赖方式诱导凋亡细胞死亡和细胞周期阻滞[16-17],并为这一药物在套细胞淋巴瘤合理有效

地利用提供了一个基础。

4.3 神经母细胞瘤Barbieri[18]等人发现在野生型p53神经母细胞瘤细胞中，MDM2的抑制增加了基因毒性药物的细胞毒性。而在含有突变型p53的前列腺癌细胞系中，Ambrosini[19]等人发现Nutlin-3提高了阿霉素诱导的细胞毒性。Peirce和Findley[20]已经将这些调查结果延伸到临床，挑战耐药性无效型p53神经母细胞瘤细胞系的治疗。他们研究了在无效型p53和阿霉素抵抗型神经母细胞瘤细胞系、LA155N中Nutlin-3诱导细胞凋亡的能力，评价了Nutlin-3与阿霉素的联合治疗的效果。他们的结果第一次表明，Nutlin-3通过TAp73的上调及E2F1的活化，提高了阿霉素对无效型p53神经母细胞瘤细胞的细胞毒性。总之，Nutlin-3在耐药性细胞中促进细胞凋亡的协同作用是明显的，无效型p53神经母细胞瘤细胞在联合治疗之后，将导致E2F1活化和稳定以及通过上调PUMA使p73功能增强。因此,Nutlin-3治疗在高侵袭性耐药性肿瘤，无效型p53神经母细胞瘤可能会被证明是有效的，特别是基因毒性的联合治疗。

4.4 骨肉瘤在骨肉瘤的模型鼠中，研究人员用Nutlins对小鼠进行每日2次，每次200mg／kg，连续给药20天后，小鼠体内的肿瘤完全消失。研究证明Nutlins对野生型p53细胞有放射增敏作用[21]，能引起更广泛的细胞周期阻滞和细胞凋亡。此外，Nutlins也可用于克服各种药物化疗引起的耐药性[22]，在肉瘤细胞株内，Nutlin-3可以增强多柔比星、顺铂类药物的细胞毒作用。这些研究提示Nutlins在野生型p53恶性肿瘤的治疗中可以作为一种有效的抗癌药物。

4.5 其他RG7112是Nutlins的一种口服制剂，在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中正在进行I期临床试验，初步结果显示，RG7112在治疗急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病以及脂肪肉瘤上具有一定的疗效，值得进行后续的临床研究[23]。近期还有研究发现Nutlins在增加卵巢癌化疗敏感性[24]、前列腺癌和神经胶质瘤[25]等方面也有一定作用。

5 结束语

综上所述，通过科研人们的努力，Nutlins已被证实能在多种肿瘤细胞中以p53依赖途径和非p53依赖途径诱导细胞凋亡、细胞死亡和细胞周期阻滞,发挥强大的抗肿瘤能力。然而，高浓度的Nutlin-3可使部分癌细胞阻滞在静止期，这些静止期的细胞在撤药之后又可以恢复细胞周期，继续生长增殖。所以迫切寻找一个合适的浓度范围的Nutlin-3，使其诱导的p73α能引起癌细胞死亡(凋亡及有丝分裂死亡)及老化，但不引起癌细胞静止，而使癌肿在化疗药物撤除后复发的可能性减少。目前，Nutlins还处于临床前期的研究阶段，如果其抗肿瘤效应能在人体内得到证实，MDM2的选择性拮抗剂Nutlins将会为肿瘤患者带来痊愈的希望。

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The mechanism and advances of Nutlins in tumor treatment.

WANG Li，WU Liqing．Medical college of Nanchang University，Nanchang 330006，China．

The mechanisms of tumor responses to chemotherapy,including apoptosis,mitotic death and senescence.One of the most serious problems in tumor chemotherapy is the existence of tumor recurrence after cessation of chemotherapy.While,the mechanism of quiescent tumor cells evading response to chemotherapy,is one of the most important reasons for tumor recurrence. Nutlins,a kind of selective small-molecule inhibitor of the MDM2 that binds MDM2 in the TP53-bindingpocket,can stop the binding of p53 and MDM2,stabilize endogenous Wt-p53 and activate p53 pathway,which leading to growth inhibition,cell apoptosis and cycle arrest including senescence and quiescent.Recent studies have found that Nutlin-3 can also stop the combination of MDM2 and p73αand increase the transcription activity of endogenous p73α.Moreover,P73α can activate p53-responsive gene, which results in inhibiting cell growth and inducing cell apoptosis.In short,Nutlin-3 can also activate p53 and p73α,which makes it has great potential to become anti-cancer drugs.This review focuses on the mechanism and development of Nutlins in tumor treatment.

Nutlins;p73;p53;MDM2;Tumor treatment

R730.23

A

1674-1129(2013)01-0039-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.014

国家自然科学基金资助项目(项目编号：30960430)；江西省自然科学基金资助项目(项目编号：20114BAB205053)

王莉，女，1987年6月生，南昌大学医学院病理学与病理生理学硕士研究生，研究方向为肿瘤分子生物学。

邬黎青，病理学博士，病理科主任，研究生导师。