干细胞治疗卵巢早衰的实验研究进展

刘 炜，周 围，童晓文，纪亚忠

(同济大学附属同济医院妇产科生殖医学科，上海 200065)

卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)是指女性在40岁之前，除妊娠外，闭经4个月或以上，卵泡期血液检查不少于2次(间隔不少于30 d)显示血清卵泡刺激素(FSH)＞40 U/L、雌二醇(E2)＜73.2 pmol/L。POF在40岁之前的发病率为1/100，30岁之前为1/1000，20岁之前为1/10000，且发病率呈逐年上升的趋势。POF在临床上并不少见，其中在原发闭经者中占10% ～28%，继发闭经者中占4% ～18%［1］。POF患者雌激素水平低下，可出现情绪不稳定、抑郁、烦躁、月经失调、性欲减退、不孕等相关症状。干细胞移植是目前国内外学者研究较多的治疗疾病的一种新方法，且已在多种疾病治疗中取得成功［2，3］。现将干细胞移植治疗POF的实验研究进展做一综述。

1 POF的治疗现状

目前查阅到的POF治疗措施主要包括心理治疗、中医治疗和西医治疗三类途径。心理治疗可作为POF的辅助治疗，因月经周期变化受下丘脑—垂体—卵巢轴的调节，所以环境、营养、心理等因素均可对此性腺轴产生影响。曹丽英等［4］认为，药物结合心理疏导治疗的疗效明显好于单纯药物治疗。中医认为本病的发病与肾虚密切相关，虽然治疗方法不统一，但所用验方基本是在古方的基础上改进或者加入西药成分形成。相关文献表明，针对所有类型 POF的中医复方治愈率为 33.33%［5］～43.59%［6］。西医治疗POF的经典方案为补充性激素，即雌、孕激素周期治疗和连续治疗［7］。陈捷等［8］采用本方法治疗40例POF患者，结果发现闭经时间1 a内的患者治疗相对有效，而对于闭经时间大于1 a的患者虽然治疗后血清FSH水平下降、E2水平升高，但与治疗前比较差异无统计学意义。李灵等［9］回顾性分析了33例采用本方法治疗的POF患者，治愈3例、有效11例、无效19例(57.6%)。

对于卵巢血管因素导致的POF患者，可以在卵巢功能丧失怠尽前尽早行血管搭桥手术［10］;另外，还有国外文献提出了基因治疗［11］和免疫学病因治疗［12］，但均未见突破性进展。故目前尚无有效治疗POF的根本方法。

2 干细胞与再生医学

近年来干细胞移植已成为治疗POF的治疗热点之一，并在实验室研究中取得一定成就。广义上讲，再生医学是一门研究如何促进创伤与组织器官缺损生理性修复以及如何进行组织器官再生与功能重建的新兴学科，其主要通过研究干细胞分化以及机体的正常组织创伤修复与再生等机制，寻找促进机体自我修复与再生，并最终达到构建新的组织与器官以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能之目的［13］。

干细胞被认为是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，分为胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(Adult stem cells，ASCs)。ESCs是来源于人和哺乳动物早期胚囊内细胞团中的一种二倍体细胞，具有全能分化性，其优点为可体外培养无限增殖、具有自我更新的能力及多向分化的特性。ASCs是成体组织中保留的未完全分化的原始细胞，目前已经在多种组织器官中被发现，其优点为获取相对容易，源于患者自身的ASCs在应用时不存在组织相容性的问题，理论上致瘤风险很低、所受伦理学争议较少，且具有多向分化潜能［14］。以往研究认为ASCs只能分化为其组织器官的细胞类型，但近几年的有关研究［15，16］正在改写这一观点。例如来源于中胚层的间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs)亦属于 ASCs［17～19］，因其来源广泛、获取容易、扩增能力强、免疫原性低、非致瘤、能归巢、无医学伦理学争议等优点而成为再生医学、细胞疗法中的主要选择细胞。

3 干细胞治疗POF研究开展的有利条件

3.1 卵巢生殖细胞恒定论已被打破 哺乳动物出生后卵泡不再更新，卵巢中不存在生殖干细胞的卵巢生殖细胞恒定论的观点来自于Zuckerman通过长达20年的研究(于1951年发表了具有里程碑意义的论文)，此观点一直以来被人们广泛接受。直到2004年Johnson等发起了对此观点的挑战，他们认为出生后的小鼠卵巢中有生殖干细胞，卵巢中有卵泡再生［18］。近几年的研究中，越来越多的证据倾向于支持卵巢中存在生殖干细胞的观点。

3.2 各种POF动物模型成功建立 POF病因及发病机制目前尚未完全清楚。特发性 POF占高促性腺激素性闭经者的81%，是POF最常见的类型，其他类型的POF涉及遗传、免疫、代谢异常、放疗化疗因素、感染因素、医源性因素及心理因素等［19］。建立理想的动物模型有利于更好地探寻治疗POF的方法。现已构建的POF模型主要有:应用免疫相关因素构建的模型［应用粗制的卵巢抗原、透明带(ZP)抗原或纯化透明带ZP3抗原免疫动物获得］;切除初生小鼠胸腺建立有自身免疫卵巢炎的小鼠模型;基因敲除建模［敲除连接蛋白37(Cx37)基因生长分化因子-9(GDF-9)、Bcl-2等方法］;针对酶缺陷所致半乳糖血症建立的半乳糖血症小鼠动物模型;物理化学因素［去氧乙烯基环己烯(VCD)、顺铂、环磷酰胺(CTX)、白消安和放射线)］所致卵巢损伤模型;临床药物损伤［高促性腺激素、雷公藤多甙片］所致卵巢损伤模型［20］。

3.3 干细胞移植在临床成功应用 对造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC)的研究始于20世纪60年代，目前其已成为研究得最为清楚、应用最为成熟的ASCs。通过移植HSC治疗血液系统恶性肿瘤的方法早已在临床广泛开展，并且成为常用治疗手段;对于其他系统恶性肿瘤、自身免疫病和遗传性疾病等其他疾病的治疗也取得了令人瞩目的疗效。以上科研成果为干细胞移植治疗POF、卵巢损伤的研究奠定了基础，促使此项技术更快地发展。

4 干细胞治疗POF的实验研究

4.1 放疗、化疗所致POF 多数研究者认为，化疗药物引起的卵巢损伤与卵母细胞及颗粒细胞凋亡密切相关［21］。2005 年，Johnson 等［22］将健康成年小鼠的骨髓，经尾静脉移植至经环磷酰胺和白消安处理后丧失了生殖细胞的小鼠体内，发现这些小鼠卵巢中有卵泡生成。2008年Fu等［23］研究发现，骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)经腹腔移植同样可以提高卵巢功能，修复化疗后卵巢结构的损伤:具体方法是建立兔磷酰胺氮芥卵巢损伤模型，将标记的BMMSCs经腹腔注射到兔双侧卵巢，在移植后2、4、6、8周处死兔，通过其动情周期、性激素水平变化、卵泡计数、颗粒细胞凋亡情况及相关凋亡因子Bcl-2、Bax评价卵巢功能情况。付霞霏等［24］也进行了类似实验，其认为BM-MSCs移植可修复CTX损伤的卵巢组织，部分改善卵巢内分泌功能。李彩霞等［25］采用白消安、CTX和放射线构建了更贴近临床放化疗损伤的小鼠POF模型，并经尾静脉向小鼠移植人类脐带充质干细胞(US-MSCs)，结果发现UC-MSCs可向POF小鼠卵巢归巢并能在局部存活生长，提示UCMSCs可能具有卵巢损伤修复作用。党建红等［26］将人脐血单个核细胞(HCMNCs)经卵巢注射至由放射线构建的小鼠POF模型体内，结果发现HCMNCs可在早衰卵巢中存活并参与卵巢功能的修复，E2、FSH、LH水平明显改善，卵巢切片示未闭锁卵泡数有所增加、可见各个发育阶段卵泡。

4.2 原发性POF 此类疾病特点是女性核型异常、闭经和不孕，伴FSH受体(FSHR)基因突变导致的FSH升高、雌激素水平降低。Ghadami等经静脉向FSH受体敲除雌鼠(FORKO小鼠)移植BM-MSCs后发现，FORKO小鼠的总体质量和生殖器官体积明显增大，卵巢HE染色显示总卵泡数及成熟卵泡数明显增加，与对照组比较，被移植动物的血清FSH值下降40% ～50%、雌激素水平增加4～4.5倍，在卵巢中可检测到FSHR mRNA。此提示经静脉注射的BM-MSCs能够到达FORKO小鼠的卵巢，可分化并表达为FSHR基因，使FSHR对FSH做出响应，从而促进雌激素分泌和排卵恢复。

4.3 卵巢自身免疫应答所致POF 近年研究显示，卵巢自身免疫应答可引起POF，并影响正常生育。自身免疫性卵巢疾病以及利用卵巢抗原作为免疫避孕疫苗引起的卵巢免疫损伤是导致POF的一个重要原因。李威娜等将BM-MSCs经腹腔移植至猪卵巢蛋白免疫损伤小鼠模型卵巢内，移植后按既定时间处死小鼠，利用PCR技术检测卵巢中GFP基因(来自GFP转基因小鼠的 BM-MSCs)以判断BMMSCs是否到达卵巢，通过对卵巢组织切片HE染色以及细胞凋亡分析检测BM-MSCs是否对免疫损伤卵巢有修复作用及其机制，结果发现BM-MSCs可直接到达免疫损伤卵巢并促进免疫损伤卵巢组织修复，其机制可能与减少颗粒细胞凋亡有关。

4.4 理化因素所致POF VCD为4-乙烯基环己烯(VCH)的代谢产物，是生产橡胶、塑料、杀虫剂、灭火剂等过程中所产生的副产品。以往研究显示，VCD能够破坏原始及初级卵泡，其机制为加速卵泡自然闭锁进程，使成熟卵泡正常排卵后无新的卵泡募集补充，最终导致雌性小鼠卵巢卵泡耗竭，引起卵巢功能衰竭［27］。王琰等利用 VCD诱导建立小鼠POF模型，经卵巢移植健康小鼠的骨髓MSCs，移植后定时取血液标本及卵巢组织，同时观察小鼠动情周期变化，结果发现骨髓MSCs可改善小鼠的卵巢内分泌功能，且能长时间存在于卵巢组织中。

对于雷公藤引起的卵巢早衰和过氧化氢引起的卵巢损伤，也有研究者进行了干细胞移植实验，结果均发现干细胞移植可促进卵巢功能恢复。

上述干细胞移植的基础研究和临床探索为POF治疗开辟了一条崭新的道路。但是，在真正将这种方法用于临床POF患者治疗前，还有很多工作要做。首先，要选择合适的供体细胞。ASCs因具有取材方便、来源广泛、免疫原性弱等优点成为理想的干细胞来源，但目前掌握的研究资料不多，有待继续深入研究。其次，应选择合适的移植方案以保证临床收益最大。需要考虑的因素包括移植细胞的保存方式、移植数量、靶点选择、免疫抑制剂的应用等。再次，应确保移植的安全性。李彩霞等［25］在实验中观察到接受移植的14只小鼠中有2只小鼠死亡，死亡原因尚不明确;其他小鼠在细胞移植后出现一过性精神萎靡、摄食差等变化，1 d左右好转。其他研究中对移植后动物的观察较少。为确保临床被移植患者的安全，预计可能出现的毒副反应以及并发症是必须要做的前期研究。总之，未来有可能通过干细胞移植促进POF患者卵巢功能恢复及有生育要求的患者自然受孕。

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