鱼类低温应激研究进展

2013-04-08章雪丹叶超霞冼健安王安利

饲料工业 2013年6期

■章雪丹叶超霞冼健安王安利

（华南师范大学生命科学学院，广东省水产健康安全养殖重点实验室，生态与环境科学广东普通高校重点实验室，广东广州 510631）

鱼类应激是指鱼类受到各种有害作用的刺激（自然环境、生物因子、人为干扰以及鱼类个体间相互作用的变化）后引起的一系列非特异性防御反应(孙儒泳等,2008)。水温是影响鱼类代谢过程的最重要外界因素之一，涉及到整个生命周期（孙德文等，2003）。低温作为应激原之一，导致鱼类生理和行为发生改变，引起其全身非特异性变化，如低温使机体的糖皮质激素分泌过多，从而严重抑制机体免疫功能，诱发疾病发生等（程军等，2004）。近年来，我国南方水产养殖业因寒潮造成重大的危害和巨大的经济损失，仅以经济损失超亿元的情况为例，水产门户网（2008）报道，2008年广东渔业经济损失超过50亿元，福建渔业直接经济损失达1.6亿元；中国食品科技网（2009）报道，2009年广东省渔业经济损失2.67亿元；广西水产畜牧兽医局（2011）报道，2011年广西渔业经济损失超过一亿元。冻灾已给水产养殖业造成了如此巨大的经济损失，目前低温应激对鱼类的影响已成为学者们重点关注的问题之一。本文就鱼类低温应激的研究进展进行综述，以期为后续更深入的研究提供参考。

1 低温应激下鱼类的生理响应

1.1 低温应激下鱼类营养物质代谢响应

1.1.1 氨基酸代谢

低温会影响蛋白质的稳定性和折叠速率，所以在低温应激下机体为了保持蛋白功能，会通过改变其离子对数目和蛋白分子间的疏水作用来调整蛋白质的灵活性(Jaenicke R，1990；Fujita J,1999)。Todgham等(2007)认为，北极鱼(Trematomus bernacchii,T.pennellii,Pagothenia borchgrevinki)泛素结合蛋白的水平比新西兰等地的鱼高，是因为在极端低温应激下，鱼体的蛋白质平衡被打乱，使更多的蛋白质变性。冀德伟等（2009）报道，当水温从20℃急性降温至8.5℃时，岱衢族大黄鱼(Pseudosciaena crocea)血清总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）浓度显著降低，但随着时间的延长，其浓度又升高。常玉梅等（2006）认为，雄性荷包红鲤抗寒品系(Cyprinus carpiovar.wuyuanensis)(♂)与雌性大头鲤(Cyprinus pellegriniPellegrini)(♀)的杂交后代F2在急性降温初期TP含量下降（水温从15℃降至6℃），但随着水温继续下降（4℃）含量有所回升；随着低温作用时间的延长（温度从16℃降至4℃后再冷驯化3 d），其TP和ALB含量显著升高，这些可能都是因温度超出鱼类耐受范围，产生应激蛋白。由此可见，在低温应激下，蛋白质分解的氨基酸，可能部分氨基酸会用于抗应激相关蛋白质合成和周转。

蛋白质分解的部分氨基酸本身可能就承担着抗应激功能（周萌等，2011）。酪氨酸是儿茶酚胺的前体物质，低温应激下动物消耗大量酪氨酸，增加髓质儿茶酚胺类的分泌，从而动员机体脂肪、肝糖原和肌糖原，促进分解代谢（程军等，2004）。分解代谢能为鱼体提供能量，有利于抵御寒冷。Chen等（2002）认为，低温应激通过影响（水温从25℃急性降至12℃）吉富罗非鱼(Oreochromis aureus)的酪氨酸代谢而影响血液中儿茶酚胺的分泌量，使由其转化的激素（下丘脑去甲肾上腺素、头肾的肾上腺素和去甲肾上腺素）含量显著下降，从而导致白细胞的噬菌作用受抑制和抗体水平降低。蛋氨酸是机体内最重要的甲基供体，能参与肾上腺素、肌酸、胆碱、肉碱的合成和核酸的甲基化过程，其含量不足会导致鱼体抵御低温的能力下降（程汉良等，2005）。有关降温对鱼类蛋白质及其代谢的影响机理还有待进一步研究。

1.1.2 脂肪酸代谢

Lyons的“膜脂相变”学说认为，低温首先是使细胞膜的膜相从液晶相变为凝胶相，低温应激下生物膜保持适当流动性跟生物耐寒性之间有一定的相关性，而生物膜的流动性主要取决于膜脂的脂肪酸组成，膜脂的不饱和脂肪酸含量和鱼类抗寒性也有一定的相关性，对低温下代谢相关基因表达的研究已在分子水平上证明了这一点，因此控制脂肪酸去饱和反应提高不饱和脂肪酸含量可以改善鱼类的抗寒性（Hsieh S L等，2003）。

低温应激下鱼体内组织细胞膜的脂肪酸组成会发生适应性变化。当体温在低温应激下降低时，对此很敏感的鱼类脂肪酸代谢，会通过积累磷脂中长链不饱和脂肪酸的含量，使膜仍保持稳定性和流动性，从而抵御寒冷(常玉梅等，2006；Farkas T，1980)。低温应激会导致鱼类脂肪酸组成改变，其中最明显的是不饱和脂肪酸比例快速上升。Hazel等(1979)报道，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)在低温适应期间肝脏膜磷脂中高不饱和脂肪酸n-3(n-3PUFA)含量相对增加，而饱和脂肪酸含量减少，单不饱和脂肪酸维持相对稳定，磷脂酰胆碱分子中C22∶6n-3(DHA)显著增加，而磷脂酰乙醇胺分子中是C20∶5n-3(EPA)增加，而不是DHA；低温应激下，虹鳟体内不饱和脂肪酸比例升高，脂肪酸去饱和反应明显变快，并且在环境温度下降时，鱼类利用恒黏性调节(Homeoviscous regulation)来改变生物膜磷脂组成，现已证实高不饱和脂肪酸n-3参与这个调节过程(Hazel J R,1984)。当水温从20℃急性降温至5℃时，虹鳟肝脏和鳃中磷脂酰乙醇(脑磷脂)含量增加而磷脂酰胆碱(卵磷脂)含量相应的减少(Hazel J R,1985)。在遮目鱼中也发现相似的变化（Hsieh S L等，2003）。Dey等(1993)报道，在冷驯化（温度5～10℃）时，海洋鱼类，包括大西洋鲱(Clupea harengus)、云斑鲉杜父鱼(Scorpaenichthys marmoratus)、大西洋庸鲽(Hippoglossus hipoglossus)和银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)等和淡水鱼类，包括欧鳊(Abramis brama)、粘鲈(Acerina cernua)和白斑狗鱼(Esox lucius)等都含有较高的多不饱和脂肪酸。Buda等(1994)报道，在冬季(温度5℃)时，鲤鱼体内不饱和脂肪酸（主要是花生四烯酸和DHA）含量增加。童圣英等(1997)认为，在越冬期时，4种鲤科鱼类(Hypophthalmichthys molitrix、Aristichthys nobilis、Cyprinus carpio L.and female grass carp,Ctenopharyngodon idella x male bighead,Aristichthys nobilis)不饱和脂肪酸含量增加，表明n-3PUFA与越冬成活率关系极大，因此，在越冬前加大配合饲料中的n-3PUFA含量，特别是EPA和DHA的含量，增大鱼体内的长链不饱和脂肪酸的积累，有利于提高其抗寒性。

低温应激下鱼类脂肪酸代谢相关的酶及其基因也发生相应的变化。随着水温下降，罗非鱼(Oreochromis mossambicus)脂肪酸去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase)基因的表达增强，它在肝脏中特异性表达，并受体内激素的调控(Hsieh S L等，2004)。当水温从25℃急性降至15℃时，遮目鱼(Chanos chanos)肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-COA desaturase,SCD)活性显著升高(Hsieh S L等,2003)。这些变化也进一步表明不饱和脂肪酸含量与鱼类抗寒性有着密切的相关性。

低温应激下鱼类脂肪酸组成的变化还表现出组织差异性。Kemp等(1970)报道，低温应激下金鱼(Carassius auratus)全鱼层面上的脂肪酸组成并没有显著变化，但组织层面上，如肠细胞黏膜的脂肪酸组成发生显著变化，其中，发生最显著变化的部位是细胞膜的脂肪酸组成。曹永长等(1991)报道，低温应激下草鱼脂肪酸组成有显著变化的部位是肌肉的线粒体膜。Craig等(1995)报道，低温应激下眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的组成比例有显著变化的部位是肌肉和肝脏。

综上，鱼类可能是通过调节脂肪酸代谢相关的酶及其基因的表达来改变不同组织细胞膜的脂肪酸组成，从而提高其低温应激下的抗寒能力。但Dey等(1992)研究发现，急性降温后，细胞膜的脂肪酸组成并没有显著变化。这可能因为脂类在急性降温应激中起次要作用，可能存在一些非脂因子，如蛋白质等在这个过程中起主要作用，有关脂类和这些非脂因子的各自作用机制还有待进一步研究。

1.1.3 糖代谢

糖类是低温应激下鱼类的重要能源物质。张瑞霞等(2008)报道，鲫的低温试验组(3.5、6.5和9.5℃)血糖浓度低于对照组（温度20℃）。Sun等(1992)报道，吉富罗非鱼血糖浓度在低温应激12 h后显著下降。在水温从25℃降至11℃后冷驯化的13 d里，各组奥尼罗非鱼（Oreochermis niloticus×O.aures)血糖含量都下降(贾明亮,2010)。而Hsieh等（2003）发现，遮目鱼在15℃冷驯化24 h后，其血糖含量和磷酸化酶a活力达到最高，果糖1，6-二磷酸酶的活力也显著升高。

鱼类体内的这些糖代谢变化是适应低温的表现，机体为了抵御寒冷，可能会加快糖的分解利用。以往的研究出现不一致的结果，可能与各自的应激时间有关：在应激初期，糖原转化成葡萄糖的速率加快，血糖浓度上升；在应激后期，血糖被大量分解生成ATP，以给机体提供能量，此时血糖浓度会降低(常玉梅等，2006)。糖代谢在低温应激中除了供能外，是否还承担了与抗应激相关的其他生理功能，以及通过哪种途径和哪种糖源作为能源还不明确，这也可作为进一步研究的方向。

综上，为了适应低温应激，鱼类体内三大营养物质的代谢都发生相应的响应。黄国强等(2010)研究褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼在12℃和17℃低温应激下对营养物质的利用，发现其能量代谢的代谢底物以蛋白质和脂肪为主。Pastoureaud(1991)指出,舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)在低温(3℃和11℃)时肝脂肪下降，利用脂肪产生能量，动用脂肪在于保证糖原水平不至于降至有害于器官代谢的程度。刘波等(2011)报道，吉富罗非鱼经(9±1)℃冷应激，血清血糖(GLU)水平在6 h，甘油三酯(TG)水平在2、6 h时有显著升高。曹永长等(1991)认为，低温(10℃)应激下草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为了适应低温，通过调节不同代谢途径酶浓度，如显著降低肝脏中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的酶活性，提高乳酸脱氢酶(LDH)的活性，这些与肝脏能量代谢相关酶的变化使肝脏组织发生了代谢途径的转换：肝脏组织中葡萄糖的有效利用受到了抑制，糖酵解作用相对增强，而三羧酸循环相对减弱，从而有利于机体总代谢，提高抗寒能力。低温（9～16℃）应激下鲫(Carassius auratus)肠道中蛋白酶和脂肪酶活性显著低于对照组(25℃)(韩京成等，2010)。由此可认为,低温应激下的不同鱼类可能有着不同的营养代谢策略来提高自身适应低温的能力。

1.2 低温应激下鱼类免疫生理响应

鱼类是变温动物，水温不仅影响其自身生理活动，同时也影响其抗氧化防御体系(Martinez-Alvarez等，2005)，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等构成抗氧化酶系统(Sies H,1993）。低温应激不仅降低鱼类的抗氧化能力，从而间接损害免疫系统，还会直接影响免疫生理，如直接影响血细胞总数、呼吸爆发功能、细胞胞浆内游离钙离子浓度（低温应激引起鱼类体内离子运转机制紊乱，破坏细胞膜的稳定性和通透性，弱化Ca2+泵的功能，使细胞膜的主动运输与渗透压调节功能出现障碍，鱼类为了提高在低温下的生存能力，通常采取降低Ca2+渗透性，以维护重要器官如心脏和大脑等的离子稳态）（Ganim等，1998）和其它的免疫相关酶等。其中，转氨酶以天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活力最强，当组织细胞，特别是肝脏和心脏等器官的细胞发生病变时，血清中转氨酶活力明显升高(王媛等，2005)，肌酸激酶同工酶(CKMB)主要存在于心肌细胞中，常通过测定其活性升高以反映心肌的受损程度（崔杰峰等，2000）。

杨严鸥等（2005）报道，当温度为10℃时，黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)红细胞和白细胞的总数最高；当水温由25℃（对照组）降至11℃时，奥尼罗非鱼血清ALT和AST活力都显著高于对照组，16～11℃时，红细胞总数显著低于对照组，11℃时，SOD活力在第14 d时显著低于对照组，CAT活力恢复到对照组水平(贾明亮,2010)；当温度由16℃降至10℃后冷驯化4 d，鲤红细胞总数在冷驯化第1 d显著升高(常玉梅等，2006)；冬季时，虹鳟白细胞总数明显减少，在整个冬季期间，呼吸爆发强度变化没有规律（Morgan等，2008）；冀德伟等(2009)报道，当低温为8.5℃，岱衢族大黄鱼随着低温胁迫持续时间(0、12、24、36 h)延长，血清ALT和AST活力升高，而碱性磷酸酶活力和血细胞胞浆内游离钙离子浓度相比于对照组呈下降趋势，CK-MB活力在24 h达到最高。当温度由16℃降至4℃时，鲤血清Ca2+含量显著下降(常玉梅等，2006)。刘波等(2011)报道，吉富罗非鱼试验组(9±1)℃的ALT水平在冷应激后2、12 h均有显著升高，AST水平在冷应激2、6、12 h时出现显著升高。张瑞霞等(2008)报道，当鲫在不同水温暂养5 d后，低温组(3.5、6.5和9.5℃)血清AST活力均低于对照组（20℃）。

综上，不同降温速率变化的低温应激下鱼类的适应也不同，当水温缓慢下降时，鱼类可能会适应这种变化而达到新的平衡；当水温急剧下降时，鱼类体内的稳定状态可能被打破，这时低温成为应激因子，导致鱼类免疫反应下降。

2 低温应激下鱼类的损伤程度

从组织、细胞和分子水平检测低温应激对水产动物损伤，有助于揭示低温的应激机制，为提高抗低温应激能力的研究提供理论基础。Hochachka等(1988)认为，当外界环境急剧变化时，会破坏鱼类内环境的稳定，导致体内组织的细胞膜受到损伤。内环境中的活性氧(ROS)会对蛋白质、脂质和DNA等大分子物质造成氧化损伤(Halliwell等，1999)。低温应激下生物体会因自由基积累而造成氧化损伤，生物呼吸能产生氧自由基，它会使不饱和脂肪酸产生过氧化反应，生成脂过氧自由基(LOO·)，LOO·又可进一步使另一个不饱和脂肪酸产生过氧化，从而引发循环连锁反应，形成最终产物——丙二醛(MDA)，膜上脂肪酸过氧化后，流动性降低，通透性增加，大量离子泄漏，引起细胞膜损伤甚至死亡(郑荣梁等，2001)。体内自由基还可攻击膜上的(Na,K)-ATP酶，使酶蛋白巯基偶联，从而引起酶活性降低，影响膜的离子转运，造成机体损伤（黄益民等，1998）。

维持鱼类体内正常生理功能的必要条件是细胞膜的流动性和完整性。低温(8.5℃)应激下大黄鱼的鳃盖、腹鳍和臀鳍基部都充血变红，其肝、肾、心和鳃等组织的细胞膜弹性和流动性都减弱，其膜脂不对称性导致膜体紧缩不均，从而引起膜的破损渗漏或通透性增大，使细胞内的溶质外流渗入血液，进而改变大黄鱼血清生化指标（冀德伟等，2009）。在低温(10℃)下处理3 d后，淡水白鲳(Colossoma Brachyponum)的细胞在电镜下可观察到核质边聚等现象，经Annexin-V-FITC/PI双染表明绝大部分细胞已经进入早期凋亡（严文静等，2005）。

目前，从组织、细胞、DNA和RNA角度检测不同的降温幅度对水产动物造成的伤害是一个新领域的探索，只有解决了低温胁迫下水产动物的营养代谢和免疫功能变化规律是否与其组织损伤、细胞凋亡有关，才能判断其应激反应程度。

3 低温应激下鱼类蛋白表达调节

早在20世纪90年代中期，随着蛋白质组概念的提出和相关研究技术的迅猛发展，现在在蛋白质水平上研究低温应激已成为可能。Devries（1971）在南极鱼类的血液中首次发现抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)后，对鱼类耐低温研究就开始侧重于AFP的研究，经多次实验研究发现，AFP与抗寒性状有密切关系(钟其旺等，2002)。最早在动物尤其是海洋硬骨鱼(Righteye floundersdun,Myoxocephalus octodecimspinosis)中发现的AFP是低温应激下生物为适应极端寒冷环境而产生的一类多肽或糖肽(Ewart K等，1999)。随着基因工程和分子生物学的快速发展和逐渐完善，AFP得到空前的应用，现已有科学家通过基因工程将AFP的基因转入到原来没有AFP的生物体内以提高其抗冻耐寒能力，从而实现不同地区生物的转移培育。李晶等(1996)报道，体内转入AFP的基因的热带罗非鱼(Oreochromis.massambicus)对低温有一定的抵抗能力。

应激情况下生物细胞内会迅速合成一种能够抑制由于ATP损耗引起的细胞凋亡的蛋白质即热应激蛋白70(HSP70)(Wang Y等，1999)。几乎所有应激的生物细胞中都经常高度地表达HSP70，这赋予了生物体细胞从应激状态中恢复的能力，形成对机体的保护性机制，抵御应激对养殖动物的影响。刘波等(2011)认为，急性低温应激[(9±1)℃]下吉富罗非鱼HSP70的mRNA水平在12 h显著升高，是因为急剧降温应激可以提高吉富罗非鱼肝脏应激蛋白HSP70的mRNA水平，从而影响其非特异免疫力和其它相关的生理指标。

徐镇等(2007)报道，在急性低温应激（8.5℃）下，大黄鱼肝脏中3个与细胞凋亡密切相关的蛋白质表达下调，分别是N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白(NSF)、角蛋白18(CK-18)和2-Cys Peroxiredoxins(2-Cys Prxs)蛋白，以及与能量需要的应激反应有关的肌球蛋白重链(MHC)表达明显上调。

综上，鱼类对低温应激的适应可能表现为许多抗应激相关的基因高于平常的转录和表达，于是与抗寒相关的蛋白出现大量表达。明确这些基因和蛋白还有待进一步的研究。