β-激动剂类兽药残留检测技术研究进展

■万宇平 凌莉 高东微冯才伟 赵 涛 刘中勇

（1.北京望尔生物技术有限公司，北京 102206；2.广东检验检疫技术中心，广东广州 510623；3.番禺出入境检验检疫局，广东广州 511400；4.湛江出入境检验检疫局，广东湛江 524022）

1 β-激动剂类兽药残留危害及限量标准

β-激动剂是一类由儿茶酚胺衍生合成的化合物，其中以盐酸克伦特罗和沙丁胺醇较为常见。

克伦特罗(Clenbuterol,CL)又名双氯醇胺、氨哮素、克喘素，是一种人工合成的β-肾上腺素受体激动剂，具有强效松弛支气管平滑肌作用[1]。克仑特罗为瘦肉精的主要成分，其可增加蛋白质的合成作用，使动物瘦肉率增加，以致被某些不法养殖户滥用，并造成在动物组织中广泛残留。当克伦特罗在动物可食性组织中残留蓄积，从而使食用这些动物组织的人产生中毒反应，危害人的身体健康，甚至危及生命安全，我国已经禁止用克伦特罗做动物饲料添加剂[2]。

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)能与β-肾上腺素能受体结合,临床上主要用于治疗哮喘、支气管痉挛等[3]。将沙丁胺醇作为饲料添加剂使用,能显著促进动物生长、增加饲料转化率和瘦肉率，但在某些养殖过程中该药物被长期、超量使用，则会在动物组织中残留蓄积，人们食用了这种动物产品后会引发中毒，危及身体健康及生命安全。

β-激动剂中最常作为促生长剂使用的是克伦特罗(Clenbuterol，CL)，但随着对克伦特罗检测力度的加大，非法使用者开始转向其他替代品。由于沙丁胺醇与克伦特罗的促生长作用相差不大，其在动物体内的消除时间比克伦特罗短,毒性较弱,因此,沙丁胺醇就成为继克伦特罗之后最主要的替代品，仍然对人们食用动物组织安全性存在极大威胁。

我国农业部235号文件规定：克伦特罗、沙丁胺醇及其盐、酯在所有食品动物及所有可食组织中禁止使用，并且不得检出。欧盟兽药残留限量标准中规定：盐酸克伦特罗含量在牛肝脏0.5 μg/kg、牛肌肉0.1 μg/kg、牛奶0.05 μg/kg、牛肾脏0.5 μg/kg、马肝脏0.5 μg/kg、马肌肉0.1 μg/kg、马肾脏0.5 μg/kg。

2 β-激动剂类兽药残留检测方法研究进展

目前检测β-激动剂类兽药残留的方法主要有两大类别：一种能够同时进行分离、分析，具有高效分离技术和高检测灵敏度，对残留情况进行定性、定量分析，主要包括液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）、气象色谱-质谱法（GC-MS）和液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用法等；另外一种是对沙丁胺醇、克伦特罗进行定性、半定量的生物学方法，该方法具有选择性高、检测限低的特点，主要有酶联免疫分析法、微生物方法和放射性免疫法等。

2.1 高效液相色谱法（HPLC）

尚红霞等提出用固相萃取-高效液相色谱法同时测定饲料中微量克伦特罗和沙丁胺醇的方法。选用Dikma Diamonsil C18-ODS分析柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),乙腈-0.01 mol/l KH2PO4(pH值3.0)作流动相,应用波长编程进行检测。克伦特罗和沙丁胺醇的线性范围为0.1～100 μg/ml，相关系数分别为0.999 99和0.999 77，检出限分别为0.31 ng/ml和0.24 ng/ml,回收率分别为91.2%～92.0%和91.9%～93.0%,相对标准偏差分别是1.20%～2.05%和1.29%～2.51%[4]。

金雁等建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定猪肉样品中克伦特罗、沙丁胺醇、土霉素、四环素残留量的检测方法。样品用0.01 mol/l EDTA-22Na、0.3%磷酸溶液、高氯酸(1∶1)的混合溶液提取，上清液过C18固相萃取柱净化，采用高效液相色谱分离，二极管阵列检测器(DAD)检测，外标法定量[5]。

出入境检验检疫的行业标准SN/T 1924—2007进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法，采用的是液相色谱-质谱/质谱法：肉和肝的测定最低限为0.000 5 mg/kg。添加0.5、1.0、2.0 μg/kg中回收率为73.4%～96.4%，98.5%～126.5%，86.5%～102.0%。

2.2 气相色谱-质谱法（GC-MS）

张雪曼等建立了尿液中克伦特罗和沙丁胺醇同时测定的GC-MS方法。尿液在碱性条件下以异丁醇提取后，用Waters Oasis MCX小柱净化，吹干后用BSTFA进行硅烷化衍生，采用GC-EI-MS法，选择离子方式采集数据。结果表明，克伦特罗和沙丁胺醇的线性范围为0.002～1.00 mg/l，相关系数分别为0.999 3和0.998 5，方法检出限可达0.5 μg/l(S/N=10)。尿液中克伦特罗和沙丁胺醇的回收率分别为75.9%～89.2%和73.6%～89.5%，相对标准偏差(RSD)均不大于 10%[6]。

农业部标准NY/T 1030—2006饲料中沙丁胺醇的测定：采用气相色谱/质谱法，适用于配合饲料、浓缩饲料及添加剂预混饲料中沙丁胺醇的测定，最低检测浓度为0.02 mg/kg。

浙江省地方标准DB33/T 624—2006动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺残留量的测定：同样采用气相色谱-质谱法，适用于畜禽肌肉、肝脏、肺、肾等组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等4种β-兴奋剂残留量的测定。方法检测限为：特布他林1.0 μg/kg、克伦特罗2.0 μg/kg、沙丁胺醇1.0 μg/kg、莱克多巴胺2.0 μg/kg。

2.3 液相色谱质谱联用法（HPLC-MS）

我国国家标准GB/T 22147—2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的测定，同样采用液相色谱质谱联用法，适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸克伦特罗的测定。标准中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的检测限均为0.01 mg/kg，定量限均为0.05 mg/kg。

SN/T 1924—2007进出口动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测采用液相色谱-质谱法。

2.4 毛细管电泳技术

陈红青等建立了高效毛细管电泳同时测定饲料中盐酸克伦特罗与沙丁胺醇的方法。通过对不同条件的考察，建立了电泳分析和样品前处理的最佳条件。方法对盐酸克伦特罗的添加回收率为83.2%～94.5%，最低检测限为0.02 μg/ml；对沙丁胺醇的添加回收率为82.5%～93.7%，最低检测限为 0.03 μg/ml[7]。

蔡春等建立了高效毛细管区带电泳技术同时快速测定饲料中的盐酸克伦特罗与沙丁胺醇的方法。对盐酸克伦特罗的添加回收率为78%～92%，最低检测限为0.5 mg/kg；对沙丁胺醇的添加回收率为74%～87%，最低检出限为0.5 mg/kg[8]。

邓光辉等建立了毛细管电泳电化学法对盐酸克伦特罗、特布他林和沙丁胺醇进行分离检测。方法采用胶束电泳体系,以铂圆盘为工作电极，考察了检测电位、缓冲液浓度和pH值、十二烷基硫酸钠(SDS)浓度、分离电压等因素的影响。3个分离物在10 kV的分离电压、缓冲体系为15 mmol/l(pH值9.0)硼砂+20 mmol/l SDS条件下得到分离。盐酸克伦特罗、特布他林和沙丁胺醇的线性范围分别为2.0～400、3.5～700、5.0～1 000 μg/l。方法已用于猪肉样品的检测[9]。

2.5 免疫分析技术（IA）

王俊平建立了沙丁胺醇直接酶联免疫快速检测的方法，从硫酸沙丁胺醇出发制备了半抗原沙丁胺醇丁二酸衍生物，用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白-钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）偶联作为免疫抗原制备了沙丁胺醇的多克隆抗体，建立了沙丁胺醇直接竞争酶联免疫检测方法，该方法抗体最佳包被抗体量为 1 μg/孔，酶标抗原稀释比例为1∶16 000，掩蔽剂采用脱脂奶粉。所建立的方法IC50为 0.90 ng/ml，IC15达到了 0.05 ng/ml[10]。

张亚峰等研制了一种简便、快速、特异性强的沙丁胺醇免疫胶体金检测试纸条，对沙丁胺醇的检测限为2.0 ng/ml，对其他β-兴奋剂无交叉反应性[11]。

汪慧荣对β-兴奋剂克伦特罗、沙丁胺醇进行了免疫检测方法的研究，以纯化的抗SAL多抗为基础，酶标板为载体建立SAL的IC-EIA方法，检测线性 范 围 为 0.5～10.0 ng/ml，IC50为 5.29 ng/ml，抗SAL多抗和CBL有较明显的交叉反应，达39.6%，表明该抗SAL多抗可同时用于SAL和CBL的检测，检测CBL的线性范围为 0.5～50 ng/ml，IC50为13.37 ng/ml。以购买的抗SAL单抗为基础，磁性微粒为载体建立SAL的“一步法”IC-EIA，检测时间2 h，线性范围0.5～100 ng/ml，IC50为11.19 ng/ml，CBL和抗SAL单抗存在极明显的交叉反应，达107%，Terbutaline和抗SAL单抗也有弱的交叉反应，为2%，其他β-兴奋剂则和抗SAL单抗无交叉反应，不同猪样品的平均添加回收率为84.3%～118.6%[12]。

2.6 生物传感分析法

侯长军等开发了一种鉴别β受体激动剂的新型阵列传感器。该传感器由8种传感物质构成，使用96孔板酶标仪采集响应数据,结合主成分分析(PCA)、分层聚类分析(HCA)、判别分析(LDA)等模式识别方法进行数据处理,对5类β受体激动剂及其混合物进行检测。PCA结果表明，该传感器主要是基于空间结构以及氢键作用实现对β受体激动剂的识别；HCA结果显示，93个分析样本归类正确；LDA结果显示，该传感器对于β受体激动剂识别的准确率达98.9%[13]。

王正武等研究了用于快速检测沙丁胺醇的电化学免疫传感器的制备方法，通过用碳纳米管-聚硫堇-纳米金依次修饰玻碳电极，再通过自组装方法得到电化学免疫传感器。能够制备得到灵敏度高，稳定性好，现场快速检测沙丁胺醇的电化学免疫传感器[14]。

3 结语

β-激动剂类兽药残留检测分析技术中，高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫测定（ELISA）方法是目前应用较为广泛并且相互补充的两种方法。HPLC，尤其是HPLC-MS联用技术，具有很高的检测灵敏度、高分离效率和高准确度，但实际检测工作中需要配备相应的大型检测仪器支持，且检测成本较高，主要适用于畜禽产品（如畜禽组织、牛奶、尿样、肝脏等样本）、饲料样本中克伦特罗、沙丁胺醇药物残留的精确定量检测。而ELISA检测方法具有快速、灵敏、方便、检测成本较低等特点，但检测结果的准确度相对仪器检测方法较不精确，侧重在临时大规模排查、检测单位常规抽检等工作中对红霉素药物的定性及半定量检测。建立以酶联免疫吸附法（ELISA）为辅的“筛选法”和液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱（GC-MS）等仪器为“确证法”的多方法相结合的残留检测体系，进行克伦特罗、沙丁胺醇药物残留检测，对于保障食品安全和人民群众健康尤为重要。