骨髓间充质细胞的研究进展

谭方正，刘新，朴成哲

(1.沈阳医学院基础医学院医学检验专业2010级，辽宁 沈阳 110034;2.基础医学院病原生物学教研室，3.沈阳医学院附属中心医院骨科)

骨髓间充质细胞 (bone marrow stromal cells，BMSCs)是指骨髓基质系统中含有的一类多能干细胞，它不表达造血干细胞的相关标志，在不同的诱导条件下，具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力。BMSCs来源广泛，可以分化为更多种类的组织细胞，分离培养较为容易，植入反应较弱，易于被外源基因转染且稳定表达。本文就BMSCs的研究进展作简要综述。

1 BMSCs的生物学特性

BMSCs具有干细胞自我修复、自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特性，不同诱导条件可使其向成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞转化，被认为是一种理想的组织工程种子细胞。BMSCs可以逃避免疫系统的识别［1］。Krampera等［2］研究BMSCs可以抑制T细胞增殖，但多数关于BMSCs免疫抑制效应的研究都是在体外进行的，其免疫逃逸和免疫抑制的确切机制尚不清楚。

2 BMSCs的分离培养与鉴定

2.1 BMSCs的分离培养方法

2.1.1 全骨髓法 利用BMSCS的较强贴壁性对其进行分离，而细胞的生存、生长需要的某些因子来自于与其伴生的其他细胞，该法在很大程度上模拟了体内BMSCS的生长环境，含有的若干生长因子及促黏附物质促进了BMSCs的贴壁生长。该方法分离的BMSCs较均一，细胞活性高，增殖能力强，原代细胞首次融合仅需7～10 d。该法这也是最常用的方法之一。

2.1.2 贴壁筛选法 利用BMSCs具有在塑料培养瓶中贴壁生长，而血细胞和造血干细胞细胞易悬浮生长的特性，逐步将非贴壁细胞核其他杂质细胞去除的一种简单易行的方法，但这种方法无法很好去除成纤维细胞，且获得的细胞纯度不够。

2.1.3 密度梯度离心法 根据BMSCs与其他细胞密度不同而采用Ficoll或Percoll分离液，通过对骨髓液进行梯度离心，去除骨髓中的血液成分，获取界面的有核细胞进行培养。使用该方法分离的细胞纯度较高，但此法常影响细胞的增殖活动且操作较繁琐。

2.1.4 免疫磁珠分选法 根据磁珠既可结合蛋白质又可被磁铁所吸附，经过一定处理将抗体或抗原结合在磁珠上，使之成为抗体或与抗体结合后，形成抗原－抗体磁珠免疫复合物在磁力作用下，发生力学移动，使复合物与其他物质分离，从而达到分离特异性抗原或抗体的目的，该方法的优点是避免了免疫毒素和补体裂解带来的非特异性杀伤作用，并可以处理大量的细胞样品。但抗体价格昂贵，普及推广受到限制。

2.2 BMSCs的鉴定 (1)形态学鉴定：BMSCs呈梭形，细胞扁平，胞体狭长，核呈椭圆形，贴壁生长，成漩涡状或辐射状排列。(2)流式细胞仪检测：CD29、CD44阳性;CD34、CD45阴性［3］。(3)BMSCs具有体外诱导分化为已知细胞的能力，目前普遍鉴定BMSCs常用的方法是：检测细胞分化后产生矿化或骨样化结节。

3 影响BMSCs向成骨细胞分化的因素与成骨细胞鉴定

3.1 诱导BMSCs成骨分化因素

3.1.1 化学药物诱导 地塞米松 (dexamethasone，DEX)、β－甘油 磷酸 钠 (sodium β－glycerophosphate，β－GP)和维生素 C(vitamin C，VitC)联合应用是BMSCs向成骨细胞分化和体外成骨的经典诱导方法，为最常用的成骨诱导剂。低剂量的DEX对BMSCs向成骨细胞分化具有促进作用，随着DEX浓度的升高这种促进作用减弱甚至转而向脂肪细胞分化。DEX在促进BMSCs骨向分化的同时可以抑制BMSCs的增殖，同时提高碱性磷酸酶 (ALP)的活性，诱导BMSCs分化表达骨钙素，增加骨桥素和Ⅰ型胶原mRNA，提高BMSCs对甲状旁腺激素和前列腺素E2反应的cAMP水平［4］，同时调节成骨细胞分泌胰岛素样生长因子，促进细胞外基质胶原合成。体外培养的BMSCs只有加入DEX才能形成钙化结节。Vit C是胶原中脯氨酸和赖氨酸末端羟基化的共同影响因子，能通过诱导成骨细胞特异性分化蛋白基因的表达来诱导ALP活性的增加，并刺激Ⅰ型胶原的合成，同时能增加钙盐的沉积和促进钙化结节的形成［5］。β－GP能提供磷酸离子作为合成ALP作用的底物，诱导和激活ALP，产生大量磷酸根离子，促进有机磷向无机磷转化，加速钙盐沉着;而且可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化，是BMSCs发生矿化结节沉积必要条件。

3.1.2 细胞因子和生长因子诱导 骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍化生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子和血管生长素等，其中骨形态发生蛋白是迄今为止已知的最强的骨诱导形成因子，其靶细胞是血液中的BMSCS，其能诱导BMSCs向软骨细胞和成骨细胞转化，促进成骨。Diefenderfer等［6］发现DEX诱导大鼠BMSCs向成骨细胞分化后对ALP有抗拒作用，而骨形态发生蛋白可诱导大鼠及小鼠BMSCs的ALP的表达。

3.1.3 物理方法诱导 体外冲击波、电磁场等物理机械刺激可经MAPK通路促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化［7］。

3.1.4 中药提取物诱导 龟甲、大黄素、巴戟天、柚皮苷等可对BMSCS诱导分化为成骨细胞。

3.1.5 转基因作用诱导 把具有成骨作用的基因转入靶细胞，由靶细胞转录成mRNA于病变区翻译成具有成骨作用的蛋白质，通过靶细胞的持续作用，促进自身成骨。2006年日本Yamanaka［8］率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4，Sox2，c－Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生诱导多能干细胞，细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

3.2 成骨细胞的鉴定

3.2.1 成骨细胞形态学观察 光学显微镜下，刚接种的成骨细胞呈球形，细胞悬液于培养液中并逐渐沉降贴壁，24 h后，存活细胞已完全贴壁展开，此时细胞形态不规则，呈多角形，有较多突起，单核呈卵圆形，1～3个核仁，胞质丰富，清晰。生长期细胞分离相多见，细胞突起互相连接，汇合时，细胞呈铺路石状，并可重叠生长，重叠生长的细胞逐渐形成细胞小结，随后胶原堆积及钙盐沉积，形成不透光矿化结节。如不传代，继续培养，细胞密度增大，可逐渐失去极性，细胞形态不易辨认。连续培养，可见胞体增大，胞质稀薄，胞核缩小，分裂相少见等退行性改变。扫描电镜观察，可见骨细胞以长梭形为主，也有多边形、椭圆形和不规则形，表面光滑，突起多而长，细胞间由突起相互连接，并重叠生长。少数细胞有分泌颗粒。连续培养的细胞，可见细胞塌陷，突起减少等退行性改变。透射电镜下可见成骨细胞胞质内有发达的粗面内质网和高尔基复合体，线粒体较多，还有溶酶体、基质小泡及糖原颗粒;细胞核大而圆，位于胞体一侧，核膜清晰，核质均匀。在原代培养的骨组织中可见细胞表面有粗而长的骨小管，骨细胞突起，胞浆内除有发达的粗面内质网和线粒体外，还有分泌小泡和糖原颗粒，细胞外有钙盐沉积在类骨质中。连续培养的细胞，胞质中显示糖原颗粒堆积。

3.2.2 源于BMSCs的成骨细胞生物学特性ALP：成骨细胞具有合成分泌ALP功能，功能活跃的成骨细胞内ALP组织化学染色阳性。基质前体染色：成骨细胞可大量合成骨基质成分，组织化学PAS染色可显示成骨细胞胞质中大小不一的红色颗粒或团块状阳性物质。胶原蛋白：Ⅰ型胶原蛋白免疫组化染色，可见成骨细胞经染色后呈棕色;Ⅲ型胶原染色片中成骨细胞偶呈淡棕色，表明成骨细胞产生少量Ⅲ型胶原，而主要合成Ⅰ型胶原。成骨细胞矿化结节：成骨细胞具有体外矿化的特征，表现为肉眼可见的白色矿化结节，是成骨细胞骨形成功能的形态表现，通常用茜素红法、Von Kossa法及四环素荧光标记法染色显示成骨细胞矿化结节，Von Kossa法矿化结节呈黑色，四环素标记法呈黄色发光结节。另外，通过矿化结节计数，可反映成骨细胞的矿化功能。雌激素受体测定：成骨细胞上存在雌激素受体，可采用3H标记雌二醇放射性受体分析法，定量检测成骨细胞上雌激素受体含量。

3.2.3 成骨细胞功能测定 增殖率测定：成骨细胞的增殖率直接反映细胞的生长情况，常用MTT比色法测定，已被广泛应用。ALP比活性检测：检测ALP比活性，可反映成骨细胞分泌ALP的功能以及成骨细胞的分化程度。分泌蛋白测定：成骨细胞是典型的分泌蛋白型细胞，具有合成分泌多种蛋白质的功能，其中骨钙素、胰岛素样生长因子1、Ⅰ型胶原、转化生长因子β与成骨细胞分化和骨形成功能密切相关。相关基因mRNA测定：用分子生物学方法RT－PCR技术检测成骨细胞骨钙素、胰岛素样生长因子1、Ⅰ型胶原、转化生长因子β、成骨生长肽等的mRNA表达水平，可反映成骨细胞的功能状态。钙摄取功能测定：成骨细胞具有摄取和释放钙的功能，可用放射性核素标记45Ca测定成骨细胞的钙摄取功能。

4BMSCs 临床应用

4.1 BMSCs在治疗骨不连中的应用 Hemigou等［9］经皮注射富含 BMSCs的骨髓治疗骨不连患者，其中90%获得成功治愈，未治愈的7例患者所接受的骨髓移植物中可形成成骨细胞的BMSCs平均浓度低于103个/cm3，所含总量低于3×104，不论是平均浓度，还是所含细胞总量都低于那些成功治愈的患者。提示移植物所含成骨前体细胞的浓度不应低于103个/cm3。

4.2 BMSCs在治疗成骨不全中的应用 因BMSCs具有多向分化潜能，Horwitz等［10］使用同种异体骨髓治疗成骨不全的儿童，在植入骨髓3个月后，骨样本组织学提示新骨形成。患者本身骨矿物质含量较正常健康小孩明显增加，表明同种异体骨髓可以引导功能性BMSCs植入促进新骨形成，提示BMSCs治疗成骨不全的可行性。

4.3 BMSCs在骨组织工程中的应用 骨髓中BMSCs含量极少，随年龄增长而成几何级数下降，因此利用BMSCs的自我扩增能力，将其在体外大量扩增，然后用于治疗。BMSCs不仅可以在体外一定的条件下分化为成骨细胞，且其黏附于一定的载体在体内也可以分化为成骨细胞，应用于骨缺损。Srouji等［11］把鼠的BMSCs种植到水凝胶上然后移植到老鼠的胫骨缺损处，6周后观察胫骨缺损处有水凝胶的免疫标记，且有完整的新骨生成。Shin等［12］把犬的BMSCs种植到部分脱钙的骨基质上来修复犬的股骨末端的骨缺损，6个月后骨缺损完全修复，这一研究为临床应用非骨水泥修复关节的缺损成型提供了实验依据。Alhadlaq等［13］用聚乙二醇凝胶安入颞下颌关节踝的解剖形态制作出假体，取小鼠BMSCs分别向软骨和成骨方向诱导后分层种植于假体上，然后将假体植入小鼠背部皮下，4周后发现植入的细胞分别表达软骨细胞和成骨细胞的表面标记物，并形成类软骨和类骨基质。

5 问题与展望

尽管近年来对BMSCs的研究取得了很大进展，但仍然存在尚待解决的问题：(1)骨髓中细胞成分比较混杂，BMSCs在骨髓中含量约为0.001%～0.01%，并随年龄的增加或体质的衰弱，BMSCs数量逐渐减少，对BMSCs进行实际应用就必须进行体外分离纯化并大量增殖，建立一套完整有效的体外培养、扩增、鉴定方法体系，在保持干细胞特性的前提下，实现快速大规模的扩增，成为基础研究和临床应用中迫切需要解决的问题。(2)BMSCs的鉴定，鉴定BMSCs的方法很多，但还没有十分可靠的准确鉴定方法，大多数方法还是通过培养过程中出现的分化表型来推论是否为BMSCs。因此，怎样准确快速地鉴定BMSCs仍是目前的一道难题。(3)BMSCs异质性研究，BMSCs的来源多种多样，为临床MSCs的适合来源提供了依据。但这些不同来源的MSCs之间存在哪些差异，相互间有何相互影响，以及在不同组织中的密度等均有待于进一步阐明。(4)干细胞发育的分子机制，Orkin等［14］认为体内可能不存在 BMSCs，只是在培养分离到的细胞时，这些细胞被激发转变或者程序重调，成为具有胚胎干细胞特性的细胞，事实是否如此还需深入研究。因此，揭示干细胞发育的分子机制的研究，干细胞移植的免疫问题，影响干细胞移植成功的因素如干细胞的来源、干细胞的发育状态、自然凋亡过程、宿主提供的微环境，都是有待深入研究和亟待解决的问题。

尽管如此，由于BMSCs具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好等优点，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞，有着广阔的临床应用前景。

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