植物多酚的分离纯化及抗氧化、降脂降糖功能研究

伊娟娟，左丽丽，王振宇，2，*

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090;2.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

植物多酚广泛存在于水果、蔬菜、豆类、谷物类等天然植物的根、茎、叶、花、果实及果皮中，具有多羟基结构为植物体主要次生代谢物，是药用植物的有效成分，具有药用保健功能［1-2］。现已有大量的实验研究报道多数天然植物提取的多酚类化合物具有强效的自由基清除力，从而能预防各种自由基导致的相关疾病的发生［2-4］。酚类化合物具有多种生理功能，包括改善心血管疾病、防癌、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抗高血糖、降血脂、调节抗氧化酶系的表达及抗炎等［5-6］多种生理功能。这都是因为天然植物中含有的大量对身体有益的活性化合物，包括植物多酚，维生素C，胡萝卜素和生育酚等多种生物活性成分。日常饮食中有目的性经常摄食富含多酚活性成分的食物能够降低各种自由基导致的慢性病的风险，例如心血管疾病、癌症、心脏病等［7-8］。多酚类化合物因天然存在于多种植物中，资源广泛，生理功能强大，应用前景广阔，而深受国内外学者的广泛关注，对其开发应用也成为时下研究的热点，如开发植物多酚应用于医疗行业作为保健品、防止治疗心血管疾病等药物，美容护肤品，食品行业的抗氧化剂等产品。

1 植物多酚的组成

植物多酚是一种重要的天然抗氧化剂，其结构以苯酚为基本骨架，以苯环的多羟基取代为特征，具有强效的自由基清除力，且具有抗氧化防衰老、降血脂、降血糖、抗病毒［9］等多项生理功能，其具有的生理功能与其结构特征、组成成分密不可分。相关资料表明多酚类物质按其苯酚环结构不同分为:类黄酮类(Flavonoids)、酚酸类(Phenolic acids)、酚醇类(Phenolic alcohols)、芪类(Stilbenes)主要包含白藜芦醇(Resveratrol)、木酚素类(Lignans)等类别;按C 骨架结构不同分为:简单酚类、苯醌类(C6)，羟基苯甲酸类(C6-C1)，苯乙酮类、苯乙酸类(C6-C2)，羟基肉桂酸类、苯丙烯类、香豆素类、色酮类(C6-C3)，萘醌类(C6-C4)，氧杂蒽酮类(C6-C1-C6)，芪类、蒽醌类(C6-C2-C6)，黄酮、异黄酮、黄烷酮、黄烷醇、黄酮醇、花色苷(C6-C3-C6)，木脂素类(C6-C3)2，双黄酮类(C6-C3-C6)2，木质素类(C6-C3)n，缩合单宁(C6-C3-C6)n等类别。其结构不同表现出不同的生理功能，这体现出一定的构效关系。

2 植物多酚的提取及纯化工艺

2.1 植物多酚的提取工艺

目前，研究植物多酚的分离提取法有溶剂法、微波浸提法、超声波浸提法、超临界流体萃取法、离子沉淀法、双水相萃取法、柱层析法等。本文将着重介绍以下几种方法。

2.1.1 生物酶法 包怡红等［10］采用酶法并以超声波辅助提取红松树皮中的多酚类化合物，以多酚得率、DPPH·清除率为参考标准优化超声波酶法的最佳工艺条件为:酶解温度45℃，酶添加量3.5%，酶解时间90min，pH4.8，在此条件下多酚得率可达77.99mg/g，对DPPH·清除率为63.17%，分离效果比传统溶剂法更佳。王华斌等［11］人也采用酶法提取石榴皮中多酚，为确定酶法提取石榴皮中多酚的最佳工艺，采用单因素实验考察不同浓度的纤维素酶、果胶酶、复合酶(不同质量比的纤维素酶和果胶酶)、酶解时间、酶解温度及酶解液pH 对石榴皮多酚得率的影响。实验结果表明，对石榴皮多酚得率影响次序依次为酶解时间＞酶浓度＞pH ＞酶解温度。当复合酶(纤维素酶和果胶酶质量比为2∶1)质量浓度为0.25mg/mL，酶解时间150min，酶解温度50℃，初始酶解液pH6.0时，多酚得率23.87%。刘军海等［12］采用的是复合酶提取茶多酚，得出最佳工艺为:提取温度60℃，提取时间80min，pH 为4.6，酶用量为0.20%，在此工艺下茶多酚提取率为13.6%。

2.1.2 超声波浸提法 Selin Sahin 等［13］用超声波辅助提取(UAE)橄榄叶多酚，设置提取参数如溶剂浓度范围为0～100%乙醇(EtOH)，固液比25～50mg/mL 和提取时间20～60min，通过响应面法(RSM)获得最佳的参数组合，本研究提取收率表达为mg 提取物/kg 干叶，总酚含量表达为没食子酸当量(GAE)/g 干叶，结果为201.2158mg 提取物/g 干叶，25.0626mg GAE/g 干叶，DPPH·清除率高达95.5610%(固液比500mg∶10mL、提取时间60min，EtOH 50%)。Muhammad K.等［14］也采用超声波助提法提取橘皮中多酚(二氢黄酮苷)，确定最优条件:温度为40℃，功率为150W，乙醇∶水为4∶1(v/v)。总酚含量相当于275.8mg 没食子酸当量/100g FW，二氢黄酮浓度为70.3mg 柚皮甙和205.2mg 的橘皮苷/100g FW 及提取率为10.9%。

2.1.3 超临界流体萃取法 景秋菊等［15］以乙醇为提取溶剂采用超临界流体萃取红松种壳内活性成分，最佳固液比1∶12，萃取时间60min，提取温度35℃;并对红松种壳的醇提物进行抗氧化功能研究，结果显示，其中部分产物具有较强的抗氧化性能，分别具有抗超氧阴离子能力，SOD 活性和清除羟自由基的能力。石莉莉等［16］采用超临界CO2流体提取花生壳中多酚类物质，根据HA120-50-01 型超临界流体萃取装置操作规程进行超临界流体萃取，萃取物经过滤、旋转蒸发及干燥后得到提取物，其中多酚类物质得率为6.19%。张青松［17］也采用超临界CO2流体萃取技术，筛选7.5%乙醇为最佳夹带剂，对萃取酿酒后葡萄皮渣中白藜芦醇萃取工艺条件进行研究。结果表明，在38℃、13MPa、萃取17min 条件下，白藜芦醇平均得率达0.087%。魏福祥等［18］通过单因素和正交实验对超临界CO2流体萃取苹果多酚工艺进行优化，最佳萃取工艺条件为:萃取压力35MPa、萃取温度50℃、萃取时间3h、物料粒度40 目、夹剂95%乙醇、CO2流速45kg/h，得率为0.1%。

2.1.4 微波浸提法 Li Yinping 等［19］采用微波助提法(MAE)快速分离提取葡萄籽中多酚化合物，经单因素及交互实验在最初五因素(提取液醇浓度，液固比，时间，微波功率和温度)中选择最具有显著影响的三个因素(提取液醇浓度，液固比和时间)，利用CCRD 实验得出最佳优化提取条件为醇浓度为47.2%，液固比是45.3∶1，时间是4.6min，通过Folin-Ciocalteau 法测定总酚含量是粗提物的92%。宋薇薇等［20］人用微波辅助法提取石榴皮多酚类化合物，确定了石榴皮多酚提取的最优工艺条件:40%(体积分数)乙醇作溶剂，料液比(g∶mL)1∶35，微波功率为242W，提取时间60s，提取三次，多酚粗提物得率26.52%。Brachet A［21］采用微波辅助提取方法从可可叶中提取可卡因和苯甲酰芽子碱，考察了提取溶剂、样品湿度、样品粒度、微波功率及照射时间等参数。所得提取物与传统方法相当，但耗时却只有30s，缩短了提取时间，提高了效率。Xuejun Pan 等［22］采用微波提取茶叶中茶多酚和咖啡因，其最佳工艺条件为预浸泡时间90min，固液比1∶20，乙醇浓度50%，微波作用时间4min，得茶多酚的提取率29.59%，咖啡因提取率4.04%，较常规提取方法节省时间。

2.2 植物多酚的纯化工艺

Wang Li 等［23］采用色谱柱法(CCE)提取分离绿茶中多酚、咖啡因和茶氨酸等物质。通过多次洗涤后得到高纯度的多酚(99%)，咖啡因(98%)和茶氨酸(98%)。Liu Dan 等［24］采用高压电子放电(HVED)法提取葡萄籽多酚并用超滤法浓缩。通过传导性裂变指数Z 和提取物中的多酚浓度来评估实验效率。实验证明，HVED 提取的多酚最大浓度可达到8.3gGAE/100wdb。Chandreyee Datta 等［25］采用Amberlite IR-400 型阴离子交换树脂吸附生姜根茎中的多酚类物质，且通过Folin-Ciocalteau 法测定总酚含量。在pH4.0 ～6.0 变化范围中，总酚吸附率在pH4.5 和5.5 可达到91%和92%。在温度25～40℃变化范围，总酚吸附率25℃时达到最大92%。随着温度的增长，吸附率也明显增加，但在40℃时只得到70%的吸附率。Cui Hai-Yan 等［26］运用正丁醇-乙酸乙酯-水(1 ∶1 ∶2，v/v/v)溶剂系统的高速逆流色谱(HSCC)装置分离纯化山楂树提取物中的活性多酚。优化在速度850r/min 流速1.5mL/min，温度25℃纯化条件时，500mg 的粗提物可在260min 内得到9.7mg纯度为94.8%的产物。Cao Xueli 等［27］采用溶剂系统是己烷-乙酸乙酯-1%水合乙酸(0.5∶9.5∶10，v/v/v)的高速逆流色谱(HSCCC)系统并结合高效液相色谱与质谱联用技术(HPLC-MS)对苹果渣中多酚分离鉴定，最佳的分离方法是利用浓度0%～100%的水合乙醇(增加梯度10%)作为洗提剂的交联葡聚糖LH-20 色谱柱分离。HPLC 分析显示，多酚主要存在于40%与50%乙醇洗脱的梯度之间。He Jian 等［28］使用混合阳离子交换色谱的新型固相萃取技术(SPE)从水果蔬菜中分离纯化高纯度花青素。使HPLC 与光电二极管阵列(PAD)和质谱(MS)探测器相连接，并运用红外线傅立叶变换(FT-IR)光谱学，紫外可见光谱分析显示获得了比用C18墨盒纯化的纯度还高的花青素。且在分离得到的12 种花青素中有8 种纯化后纯度高达99%(紫外可见色谱)。表明这种新型的方法有效的去除了非花色苷酚类物质，在保证最佳复原率和最低消耗的前提下显著地提高了花青素的纯度和收率。

3 植物多酚的生理功能

3.1 抗氧化功能

天然多酚类生物活性物质具有潜在的保健功效，研究表明多酚类化合物能够清除体内过剩的自由基，主要是它结构中能提供氢原子或螯合剂来发挥抗氧化作用。Sindhu Mathew［29］等研究樟树皮提取物(CBE)的抗氧化活性和含有的多酚类化合物有关;其表现出很强的自由基清除能力尤其清除DPPH和ABTS 自由基的能力强。氢氧阴离子和超氧阴离子也可被清除。CBE 也表现出具有金属螯合能力及过氧化抑制能力，以上特性均体现出CBE 有非常好的抗氧化活性;另外，Y Choi［30］等研究香菇提取物中释放和结合的多酚和黄酮类化合物的生理活性，也通过对其ABTS 和DPPH 自由基清除力分析，提取物表现出良好的抗氧化活性及清除自由基的功能。苏晓雨等［31］利用从红松种子中提取的多酚物质进行体内和体外抗氧化实验，结果表明红松种子提取物可以抑制由γ-射线引起的氧化损伤，可以增加超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽酶(GSH)的水平，降低丙二醛(MDA)的含量，表现出很好的抗氧化活性。

O.Benavente-Garcia 等［32］从橄榄叶提取物中分离出的多酚及黄酮类化合物清除ABTS 自由基的能力和它们结构中的相关官能团有关，主要和B 环邻苯二酚、3 羟基官能团和2，3 双键共轭含氧官能团有关。对于其它的开环多酚化合物，它们清除ABTS 自由基的能力主要和它们结构中自由羟基官能团的数量和位置有关。而且，当混合时化合物的官能团表现出和开环中一样的协同作用。Maria 等［33］发现胃消化能显著影响大豆中生物活性物质的释放，增加总酚类物质浓度(福林酚法35%和14%)，总异黄酮含量(22%)和总抗氧化活性(76%)。这表明体内胃肠消化(包括透析)对大豆酚类化合物、异黄酮等物质的抗氧化活性有显著影响。

在深入研究和相关理论基础上均表明，多酚类物质有很好的抗氧化能力，延缓衰老进程，提高生命力及生存等能力，对防止疾病和人的健康有积极的作用［34］。

3.2 降血脂作用

Rishipal R 等［35］用花生皮(PE)水溶性多酚喂食Wister 鼠10 周后，高脂老鼠体重和附睾脂肪显著降低，且血液中和肝脏内甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平也明显降低而粪便胆汁酸含量增加。肝脏脂肪酸合成酶(HMG-CoA 还原酶、酰基辅酶A-胆固醇)活性降低，固醇受体元素结合蛋白SREBP-1C、乙酰辅酶α 羧化酶(ACC1)活性下降，但过氧化物酶增殖物激活的γ 受体(γ-PPAR)有所增加，使高脂大鼠体内胆固醇和脂质含量有所改善。赵磊等［36］通过高脂饲料法建立了高血脂大鼠模型，用香蕉皮多酚灌喂高脂大鼠40 天后，与正常对照组相比TG(1.14±0.21)mmol/L，TC(3.06 ± 0.24)mmol/L，LDL- C(2.97 ±0.12.)mmol/L 水平明显升高，HDL-C(0.89 ±0.11)mmol/L 水平降低，表明香蕉皮多酚具有一定的降血脂预防动脉粥样硬化形成的作用。

Hiroshi S 等［37］喂食高脂小鼠核桃活性提取物(WP，45%多酚)，口服WP(100mg/kg 和200mg/kg)能显著降低肝重量和总TG 含量及抑制油酸诱导的HepG2 细胞的 TG 积累，酰基辅酶 A 氧化酶(ACOX1)活性通过喂食WP(50～200mg/kg)有所增强。另外，添加100μg/μL 的WP 能显著提高α(PPAR-R)的mRNA 的表达，证实了核桃内核薄膜内富含的鞣花单宁具有降脂功能。Yang Deng-Jie等［38］鉴定出龙眼花水提物(LFWE)中含有大量的多酚类物质如酚酸和类黄酮，并用LFWE 喂食高脂大鼠后，老鼠体重、附睾脂肪量、TG、肝动脉粥样化指数，脂质含量均有所减少;食用2.5% LFWE 导致高脂鼠脂肪酸合成酶活性降低而减少脂肪酸的合成，增加了粪便排泄物中TG 含量。因此，证实了富含多酚的LFWE 确实具有体内降血脂功效。

Yin Peipei 等［39］用板栗花刺果提取物(CMPE)喂食STZ 糖尿病大鼠(口服剂量300mL/kg)，每天两次连续12 天后，CMPE 使血清葡萄糖、TG、TC、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)水平以及在脾脏和肝脏组织的MDA、GSH 水平大幅度减少。结果表明CMPE有开发成降血脂药物的潜能。Zou Bo 等［40］研究柿子单宁酸(HMWPT)发现此类化合物能明显降低TG、TC 和LDL-C 含量及血清载脂蛋白-B(Apo-B)、MDA 水平，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量增加。此外，100mg/kg 体重/天的HMWPT 处理能显著提高血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性且总抗氧化作用能力(T-AOC)增强，粪便胆汁酸含量也明显增加。这些结果表明HMWPT 具有良好的降血脂功效。

3.3 降血糖作用

A Prathapan 等［41］对木橘果肉提取物(AME)进行糖尿病相关参数评估，AME 表现出显著的自由基清除活性及抑制超氧化物、羟基和一氧化氮自由基的能力且与α 生育酚(EC50值为(220.15 ±0.91)μg/mL)标准物比较，AME 可以显著抑制脂质过氧化(302.42 ±1.25)μg/mL 反应。AME 也可剂量依赖性抑制α 淀粉酶(430.51 ± 1.61)μg/mL 和新型α-葡糖苷酶(294.4 ± 0.85)μg/mL 活性并发挥重要的抗糖化潜能。

Diana E 等［42］研究吸附到脱脂大豆粉(DSF)上的浓缩葡萄多酚对高血糖鼠血糖水平的影响。实验表明1g 附着DSF 的葡萄多酚浓缩液含1.6～10.4mg的花青素，7.5 ～93.1mg 的原花青素及20.5 ～144.5mg总多酚。结果显示吸附DSF 的葡萄多酚能显著降低C57BL/6J 高血糖鼠的血糖水平。Pradeep Visen等［43］研究证实了欧洲白蜡树种子提取物活性物质的降血糖作用。Elisa Vega-Avila 等［44］人也研究了长春花多酚活性物质的降血糖的活性，和甲糖宁比较长春花、叶、茎、根提取物活性物质都能更好的降低四氧嘧啶诱导(75mg/kg)糖尿病鼠的血糖水平。

Sang C 等［45］通过给注射链脲霉素STZ(50mg/kg体重)诱导的2 型糖尿病大鼠喂食双孢菇提取物(ABP200mg/kg 体重)有显著降低血浆葡萄糖、TG、TC、LDL 浓度(分别为24.7%、39.1%、22.8% 和33.1%)的效果，肝脏内TG、TC 及丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性也分别降低了20.8%、36.2%、11.7%和15.7%，且伴随HDL 含量显著升高。

M.S.Deutschlander 等［46］从 Euclea undulata var.mvrtina 根皮中用丙酮提取出4 种化合物，结果鉴定出一种新的三萜烯为α-香树酯醇-3 氧-(5 羟基)阿魏酸和三种化合物分别为桦木醇、羽扇豆醇和表儿茶素，体外C2C12 肌细胞实验表明，在浓度200.0μg/mL，IC50值为4.79 的条件下，表儿茶素能降低血糖水平，而三萜烯有抑制葡糖苷酶的效果。Adam J.等［47］用黑果梨多酚活性物质，特别是花青素苷(56.6%)喂食高血脂鼠后，测定麦芽糖酶和蔗糖酶活性均有所下降，粘膜乳糖酶活性增加，抗氧化性能有所改善，特别是改善了器官组织(肝脏、肾脏和肺)中脂质过氧化指标物(TBARS)的活性，胆固醇和血糖浓度也不同程度的有所下降。

4 展望

目前，随着对多酚研究的增多以及技术开发水平的深入，多酚的分离提取工艺已经日渐精深，国内外对其生理功能和药效价值的研究也更加全面，但植物资源利用深加工程度低，加工过程中一些副产品中植物多酚利用率低，且缺乏工业化生产体系，因此应在充分利用现有的技术手段和科研条件的前提下，逐步完善以上不足。科研工作者也应该从长远角度出发更加深入的研究植物多酚的生物活性及功能，不断以新的方法探讨新的作用机制，力争从多途径多位点着手开发出更有效的延缓衰老、防止和治疗高血脂、高血糖等现代慢性疾病的天然保健品。只有对植物多酚此类物质更加全面、清晰的认识，才能更加充分、合理、科学地利用此宝贵的自然资源，才能更安全的将其应用于各食品、医药保健以及化妆品行业。综上，对植物多酚的精细化加工和高附加值深度开发利用(如生理活性、食品及营养)是目前的主要研究方向和应用发展趋势。

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