葡萄糖氧化酶的应用进展

杨久仙 ，曹靖

（北京农业职业学院，北京102442）

葡 萄 糖 氧 化 酶 （Glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，简称 GOX）为需氧脱氢酶 ，也称葡糖氧化酶，其系统命名为β－D－葡萄糖氧化还原酶。GOX是从特异青霉（Penicillium notatum）等霉菌和蜂蜜中发现的酶，在氧气存在的情况下能高度专一性地催化β－D－葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢［1］，广泛应用于发酵工程、食品添加剂、动物饲料添加剂、生化材料、检测试纸和生物传感器等方面［2，3］。GOX广泛存在于动物、植物和微生物体内，其中微生物（黑曲霉和青霉）以其生长繁殖快、分布广泛的特点成为生产GOX的主要来源。

1 GOX制备方法进展

葡萄糖氧化酶主要存在于微生物体内，动植物体内含量不丰富，提取也有一定的局限性。霉菌作为普通微生物，培养简单，生成的GOX较多，可以大规模生产。现阶段主要用于制备GOX的微生物是霉菌中的黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉菌（Penicillium notation）［4，5］。

从黑曲霉中生产制备GOX的工艺流程为：

黑曲霉细胞的培养→过滤，留滤液→酸化至pH为4.0～4.5→离子交换柱分离→缓冲液洗脱→离心→收集饱和沉淀液→结晶→冷冻干燥→成品

成品活性检测方法主要有：分光光度法、荧光法、电化学法等，在测定中影响测定结果的主要因素有：温度、pH、供氧量等。

2 GOX生物学特性及作用机理

高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，分子量为160 000左右，每摩尔酶中含2mol FAD，易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂，50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。一般制品中含有过氧化氢酶。酶在波长为377nm和455nm有最大吸光值，在热、酸或碱处理后产生特殊的绿色，在紫外光下无荧光。固体酶制剂在0℃下至少可保存两年，在－15℃下可保存8年。GOX的最适pH范围为3～4，最适pH为5，没有该酶的保护剂如葡萄糖存在或pH大于8或小于3，该酶将迅速失活。GOX的最适作用温度为30～60℃。EDTA、KCN及 NaF不能阻抑该酶，但Hg2Cl2、AgCl、对氯汞苯甲酸和苯肼对酶有阻抑作用［1］。

在生物反应体系中，GOX与过氧化氢酶（CAT）组成一个氧化还原酶系统。在氧气存在条件下，GOX能氧化葡萄糖生成D－葡萄糖酸内酯和H2O2，CAT作用于 H2O2分解生成 H2O和1／2 O2，H2O再与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。在该反应中，GOX的特点是消耗氧气，催化葡萄糖氧化。在CAT存在下，每克分子GOX消耗1克原子氧；没有CAT存在时消耗1克分子氧；在乙醇和CAT存在下，也消耗1克分子氧［1］。

GOX的抗菌特性是由于反应产物H2O2具有灭菌作用。提纯物含有2分子的FAD，作为电子受体，除 O2外，也能与2，6－二氯酚靛酚反应［1］。

GOX是葡萄糖氧化的特异性酶，对葡萄糖的氧化作用具有特异性。米氏常数Km较低（10～3 M）。由于生成H2O2的量一定，所以可以作为D－葡萄糖的定量试剂，广泛应用于生物化学领域和临床检测。

3 GOX的应用

3.1 GOX在食品工业中的应用

3.1.1 延长食品保质期

美拉德反应是食品产品褐变的主要原因。食品加工过程中，部分糖蛋白分解后，还原糖的醛基和氨基酸的羧基发生反应。在GOX过氧化氢酶系统下，食品中葡萄糖分子的醛基转变为羧基，生成葡萄糖酸，从而不能与氨基酸的羧基发生反应而消除了美拉德反应。因此，GOX过氧化氢酶系统在蛋品、薯类制品、果酱制品以及海鲜制品中应用广泛，对产品保质期的延长具有重要作用［1］。如在制作脱水蛋粉时，利用GOX氧化除去在脱水与贮存过程中蛋粉存在的少量葡萄糖，防止其与蛋粉蛋白中氨基酸产生美拉德反应，从而防止了褐变反应的发生［6］。

在包装食品中也广泛应用葡萄糖氧化酶。在瓶装及罐装食品中，多酚氧化酶和过氧化氢酶在有氧气时会发生作用而引起食品质量变质。添加少量的葡萄糖氧化酶，消耗氧气，可阻止产品质量恶变。在粉状包装食品（瓶装及罐装）贮存时，因密封性差，在薄膜及包装纸表面附葡萄糖氧化酶，可以去除氧气，提高食品的保存效果。

3.1.2 保护还原性物质

果汁、茶饮料、葡萄酒、啤酒、蛋黄酱、果酱等食品中含有黄酮、亚油酸、亚麻酸等还原性物质，这些还原性物质在有氧条件下发生氧化反应，会使这些食品浑浊、沉淀、变色。在加工过程中加入适量GOX或GOX－过氧化氢酶复合物，可保护食品中的还原性物质，有效地去除此类氧化反应。

在啤酒生产中，GOX能防止啤酒氧化，保持啤酒风味，延长保质期。其主要作用机理是除去啤酒中的溶解氧和瓶颈氧，阻止啤酒生产过程中的氧化变质，使氧与啤酒中的葡萄糖生成葡萄糖酸内酯而消耗溶解氧，反应产物葡萄糖酸内酯，性质稳定，不具有氧化能力，没有酸味，无毒副作用，对啤酒的质量没有影响。GOX具有酶作用的专一性，不会对啤酒中其他物质产生作用［7］。

葡萄酒和葡萄汁的生产中也广泛应用葡萄糖氧化酶。GOX消耗葡萄酒中的氧，阻止微生物的生长，提高红葡萄酒的稳定性。在白葡萄酒的生产中，GOX的作用尤为重要。由于白葡萄酒的生产原料葡萄皮、葡萄梗、葡萄籽中含有较多的酚类和多酚氧化酶，有氧气存在，就会发生褐变反应，加入GOX－CAT体系，可有效地去除氧，防止褐变反应的发生。

GOX也应用于果汁和蔬菜汁的生产中。Vc是果汁和蔬菜汁中含有的主要的营养元素之一，但它容易被溶解在果汁和蔬菜汁中的氧氧化破坏，添加适量的GOX与葡萄糖，可有效地保护Vc不被氧化［8］。

3.1.3 杀菌作用

GOX能消耗环境中的氧，阻止好氧菌生长繁殖，产生过氧化氢，从而起到杀菌作用。

3.1.4 提高外观品质和适口性

GOX催化葡萄糖氧化反应生成葡萄糖酸和强氧化剂过氧化氢。过氧化氢使面筋分子中的巯基（·SH）氧化成为二硫键（·S－S·），明显改善面粉的粉质曲线特性、拉伸曲线特性。所以，GOX可以作为面粉改良剂和面包品质改良剂。GOX在面粉和各类制品生产中，如焙烤面包、面条制作及各种高面筋面粉的生产都有应用，均有理想效果，可替代各种化学添加剂（溴酸钾等），降低成本。在面粉中添加GOX，可以改良面粉品质，强化面粉的筋力，增加面团的耐机械性能，使面团更柔软、稳定，具有良好的操作性，面包的比容和质量都有相应改善，同时，还可以提高面包的入炉急胀性，增大面包的体积，改善面包的色泽以及内部的组织结构。GOX比溴酸钾对面包的抗老化性能效果好［9，10］。

3.1.5 葡萄糖的定量分析

GOX对底物具有严格的专一性，能专一氧化葡萄糖，故可用于测定各种食品和混合物中葡萄糖的含量。目前用固定化技术制成的GOX分析仪已用于测定发酵液中葡萄糖的残糖量［11］。据此原理制成的葡萄糖测定试剂盒，可定量测定果汁、饮料及牛奶等多种食品中葡萄糖的含量。

3.2 动物饲料添加剂

配合饲料中常添加多种维生素、鱼粉和油脂类，以平衡蛋白质、维生素和无机盐等营养成分。但是，一些成分如脂肪、维生素A、胡萝卜素等容易氧化变质，甚至产生一些有害物质，危害畜禽健康。安全性高、效果好的抗氧化剂在饲料中的添加可以有效地避免其不利影响、减少饲料营养物质损失和氧化变质。GOX作为一种抗氧化剂，已应用于畜牧业中。

3.2.1 延长饲料保存时间

GOX的催化反应过程中可以生成H2O2同时消耗大量的氧气［4］，能够起到杀菌的作用。猪全价配合饲料中含有大量的玉米、豆柏等易霉变原料和脂肪、维生素等易氧化变质成分，H2O2具有的高效的杀菌能力，可以抑制霉菌，降低霉菌毒素的含量，同时低氧的环境可减少饲料的营养的损失［12］。

3.2.2 改善胃肠道pH值

GOX催化葡萄糖生成葡萄糖酸，可以作为胃肠道中的酸化剂。饲料中添加的GOX进入胃肠道后，发生氧化反应，不断产生葡萄糖酸，使胃肠道pH值降低。在偏酸的环境中，各种消化酶的活性都得到极大发挥，有助于饲料的消化［13］。G Biagi等通过体外试验报道了葡萄糖酸在仔猪上的应用，经过4h、8h和24h的发酵试验，盲肠液中的氨显著减少；发酵24h后，总脂肪酸、乙酸、丙酸、n－丁酸、乙酸丙酸比、乙酸＋丁酸与丙酸比都极显著的增加［14］。

3.2.3 维持肠道菌群生态平衡

GOX在催化肠道内的葡萄糖发生反应的过程中消耗肠道内的氧气，为厌氧有益菌的生长创造有利环境。反应产物葡萄糖酸还可降低胃肠内pH值，为乳酸菌生长创造酸性环境，乳酸菌的大量生长有利于饲料的消化。同时，反应生成的过氧化氢还具有灭菌作用，当过氧化氢积累到一定浓度时，直接抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌和弧菌的生长繁殖［15］。GOX在维持肠道菌群生态平衡中使有益菌大量增殖，抑制有害菌的生长，从而防止了有害菌的感染，提高了机体的免疫力。GOX可有效防治猪的生理性顽固腹泻。

3.2.4 保护肠道上皮细胞完整，提高饲料的吸收效率

猪处于应激状态时，机体会产生大量的氧化自由基，引起肠道上皮细胞破坏。GOX具有抗氧化作用，能清除自由基，保护肠道上皮细胞完整，从而阻挡病原体的侵入，提高肠道对饲料的吸收效率［16，17］。杨久仙等GOX对断奶仔猪生产性能的影响研究中发现，日粮中添加0.3%的GOX日增重提高8.2%（P＜0.05）；饲料转化效率趋于提高（7.9%，0.05＜P＜0.15）［18］。

3.2.5 解除中毒反应

GOX不仅可以解除霉菌毒素中毒反应还可以解除其他药物中毒反应。GOX直接抑制黄曲霉、黑根霉、青霉等多种霉菌，对黄曲霉毒素B中毒症有很好的预防效果。猪食用发霉饲料后，毒素会造成胃肠道疾病，同时免疫力下降引发各种病原的共同感染，导致免疫抑制反应。饲料中添加GOX，可以一定程度地解除饲料中真菌毒素的危害，提高动物免疫力。GOX也能解除药物中毒，其作用原理是，GOX进入消化道，其中一部分进入肝脏，催化肝脏内的氧化还原反应的发生，加速了毒性成分的分解［19］。

3.2.6 减少抗生素的使用

猪的大规模集约化饲养增加了疾病的易感性，使生产中不得不使用大量抗生素。抗生素的滥用造成了大量耐药性强的新型病原的出现，危机养猪业的持续发展；同时导致肉类产品的药物残留，危害人类健康。杨久仙等发现在猪的饲养过程中，添加适当剂量的GOX可以减少或替代抗生素达到减少疾病发生率、提高生成性能的作用［18］。

3.3 检测试纸应用

3.3.1 尿糖测定试纸

尿糖试纸用于检测尿液中的葡萄糖含量。其原理是，GOX酶促反应过程中产生的过氧化氢可被过氧化氢酶催化分解，产生水和原子氧。氧原子可将试纸上吸附的无色还原性邻联甲苯胺染料氧化成蓝色物质。蓝色物质的生成量与葡萄糖浓度成正比，从而计算葡萄糖的量。

3.3.2 血糖测定试纸

目前已有商品化的GOX与过氧化物酶偶联（GOX－POD）法测定血糖含量的试剂。试纸使用简单、无毒、无害、易控制，临床上已广泛应用。

3.4 生物传感器

生物芯片中GOX电极传感器和生物传感器中GOX的应用研究最具经济价值。GOX是生物传感器领域最常用的工具酶。GOX生物传感器可用于实时检测发酵过程中葡萄糖的浓度，以控制食品加工生产过程中葡萄糖的含量［20］。GOX电极传感器还可用于监测植物种子中氧的消耗，主要根据GOX在反应中消耗氧的量，应用蛋壳膜传感器来实现。此种方法干扰因素少，测定数据准确［21，22］。土壤成分的测定中也可以应用这种GOX电极传感器，在酸性环境中，Hg与GOX活性中心的某些位点结合，从而抑制酶活性，以测定土壤浸出液中汞离子的回收率［23］。GOX电极传感器还广泛用于免疫测定中［24，25］，根据单克隆抗体抗链霉素、青霉素及磺胺类药物的原理，建立GOX半抗原快速测定技术，分析牛奶中的抗生素，具有专一、灵敏、快速等优点［26，27］。

3.5 医药行业中的应用

GOX和乳酸过氧化氢酶（LPO）、淀粉葡糖苷酶、葡聚糖酶、溶菌酶等酶制成的酶制剂可除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成。药物中添加一定量的GOX，稳定性可提高3倍。含有GOX、LPO和含碘化合物等成分的制剂，可制成口腔药物，还可添加在化妆品中，具有抗头皮屑的作用。含有GOX和LPO的双酶口香糖，在咀嚼时抑菌率可达96%～99%。GOX也可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。作为试剂盒、酶电极等，GOX可用于体外血清（浆）、尿液及脑脊液中葡萄糖的大量分析［2］。

4 结语

GOX可以延长食品的保质和保鲜期，其在食品中的应用范围可以进一步扩大。GOX在动物体内的作用机理、副作用有待进一步研究。如何更经济、更有效地制备和提纯GOX及其提纯方法、范围是今后研究的方向。随着研究的不断深入，GOX的应用前景将会更加广阔。

［1］王璋.食品酶学［M］.北京：中国轻工业出版社，1990.

［2］李丹，李静.葡萄糖氧化酶及其应用［J］.食品工程，2006（3）：351－358.

［3］Sandip B.Bankar，Mahesh V.Bule，Rekha S.Singhal.Glucose Oxidase－An overview［J］.Biotechnology Advances，2009，27（4）：489－501.

［4］王志新，李宁，韩军，等.黑曲霉 A9葡萄糖氧化酶的提取纯化［J］.中国食品学报，2007，7（1）：64－68.

［5］母敬郁，王峤，杨纯中，等.瑞氏木霉表达黑曲霉葡萄糖氧化酶［J］.生物工程学报，2006，22（1）：82－86.

［6］徐雅琴，杨严俊，曹如燕.葡萄糖氧化酶法去除蛋清中葡萄糖的工艺研究［J］.食品与发酵工业，2005，31（2）：55－58.

［7］黄惠芝，马林，黄春波.葡萄糖氧化酶延长啤酒保鲜期的研究［J］.中国食品卫生杂志，2000，12（3）13－15.

［8］马清河，胡常英，刘丽娜，等.葡萄糖氧化酶在果汁保鲜中的应用［J］.中国食品添加剂，2005（1）：77－78.

［9］林家永，李歆，封文瑞.葡萄糖氧化酶与脂肪酶改善面粉质量的作用［J］.粮油食品科技，1999，6（7）3－4.

［10］赵海军，李晓宇，柳菊香.复合添加剂在永良4号小麦面包粉中的应用［J］.粮食与饲料工业，2004（5）：4－5.

［11］王树庆，刘秀华.葡萄糖氧化酶及其在食品工业上的应用［J］.食品科技，2001，（3）：30－31.

［12］吕进宏，黄淘，马立保.新型饲料添加剂——葡萄糖氧化酶［J］.中国饲料，2004（12）：15－16.

［13］宋海彬，赵国先，李娜，等.葡萄糖氧化酶及其在畜牧生产中的应用［J］.饲料与畜牧，2008（7）：37－39.

［14］G Biagi，A Piva，M Moschini，et al.Effect of gluconic acid on piglet growth performance，intestinal microflora，and intestinal wall morphology［J］.Journal of animal science，2006（84）：370－378.

［15］Gu X，D Li，R She.Effectof weanling on small inteatinal structure and function in the piglet［J］.Arch，2002（56）：275－286.

［16］Tsukahara，H Koyama，M okada，et al.Stimulation of butyrate production by gluconic acid in batch culture of pig cecal digestion and identification of butyrate－producing bacteria［J］.J Nutr，2002（132）：2229－2234.

［17］Van Beers－Schreurs H M，M J Nabuurs，Vellenga L，et al.Weanling and the weanling diet influence the villous height and crypt depth in the small intestine of pigs and alter the concentrations of short－chain fatty acids in the large intestine and blood［J］.J Nutr，1998，128（6）：947－953.

［18］杨久仙，张荣飞，马秋刚，等.葡萄糖氧化酶对断奶仔猪生产性能的影响［J］.黑龙江畜牧兽医，2011（2）：56－57.

［19］赵晓芳，张宏福.葡萄糖氧化酶的功能及在畜牧业中的应用［J］.广东饲料，2007，16（1）：34－35.

［20］张广栋，罗仓学.生物传感器及其在食品工业中的应用［J］.食品研究与开发，2005，26（1）：133－134.

［21］Wu B，Zhang G，Shuang S.A biosensor with myrosinase and glucose oxidase bienzyme system for determination of glucosinolates in seeds of commonly consumed vegtables［J］.Sens Actuat Chem，2005，106（2）：700－707.

［22］于洋，赵林，闫博，等.基于有机——无机杂化材料和铂电极的葡萄糖氧化酶电极的研究［J］.传感技术学报，2007，20（2）：258－261.

［23］汤琳，曾光明，沈国励，等.基于抑制作用的新型葡萄糖氧化酶传感器测定环境污染物汞离子的研究［J］.分析科学学报，2005，21（2）：123－126.

［24］Changsheng Shan，Huafeng Yang，Jiangfeng Song，et al.Direct Electrochemistry of Glucose Oxidase and Biosensing for Glucose Based on Graphene［J］.Analytical Chemistry，2009，81（6）：2378－2382.

［25］Wu B，Zhang G，Shuang S，et a1.Biosensors for determination of glucose with glucose oxidase imm obilized on an eggshell membrane［J］.Talanta，2004，64（2）：546－553.

［26］Strasser A，Dietrich R，Usleber E，et a1.Immunochemical rapid test for multiresidue analysis of antimicrobial drugs in milk using monoclonal antibodies and hapten·glucose oxidase conjugates［J］.Anal Chim Acta，2003，495（1）：11－19.

［27］Ping Wu，Qian Shao，Yaojuan Hu，et al.Direct electrochemistry of glucoseoxidase assembled on graphene and application to glucose detection［J］.Electrochimica Acta，2010，55（28）：8606－8614.