调节性T淋巴细胞在乙型肝炎慢性化过程中的作用＊

卢 林，曾令伟综述，秦 波审校

（1.重庆市渝北区人民医院感染科 401120；2.重庆医科大学附属第一医院感染科 400016）

具有免疫抑制功能的Th细胞过去被称为抑制性T淋巴细胞（suppressor T cell），近年来研究发现其能够介导免疫耐受并抑制自身免疫性疾病，故更名为调节性T淋巴细胞（regulator T cell，Treg）。越来越多的证据表明，Treg在抑制抗病毒T细胞免疫应答过程中发挥重要的作用。一方面，Treg抑制过强的T细胞免疫应答避免对机体造成过度损伤；另一方面，由于限制了T细胞的抗病毒反应，病毒不能被及时清除而可能引起感染的持续存在，从而导致乙肝病毒感染后疾病慢性化的发生。

1 Treg的分类及表面标志

Treg是一组异质性的细胞，按照其来源及功能不同主要分为两大亚群：一种是自然性Treg，由胸腺的T细胞发育而成；另一种是适应性Treg，由成熟T细胞或正在分化中的自然性Treg在一定条件下生成，如存在转化生长因子-β（TGF-β），抗原暴露少或者共刺激不足等［1］。自然性Treg包括CD25＋FoxP3＋T细胞以及来自先天免疫系统的自然杀伤细胞（NK）。体外实验证实，自然性Treg的功能是通过抗原非特异性、接触依赖但不依赖细胞因子的途径实现的［2］。适应性Treg包括CD4＋CD25＋FoxP3＋T 细胞、产生白细胞介素-10（IL-10）的CD4＋T细胞（Tr1）、产生 TGF-β的CD4＋T细胞（Th3）、CD3＋CD4-CD8-T细胞［3-4］。适应性Treg在体内的免疫调节功能是通过细胞因子途径来实现的［5］。另外，一些CD8＋T细胞也具有免疫调节功能，CD8＋CD25-T细胞在抗原存在的情况下能够分化成CD8＋Treg［3，6］。然而，目前针对 CD8＋Treg的研究还非常少，对CD8＋Treg的作用功能也还知之甚少。

到目前为止，还没有一种完全特异的细胞表面标志可以区分Treg，其中，白细胞介素-2（IL-2）受体α链（CD25）是Treg的一个原始标志。将CD4＋CD25＋T细胞转移至T细胞缺失的小鼠可以预防自身免疫性疾病，而将去除了CD25＋T的CD4＋T细胞移入该类小鼠则不能避免发生多器官特异的自身免疫性疾病。然而，自然产生的T淋巴细胞毒性相关抗原-4（CTLA-4）＋肿瘤坏死因子受体（GITR）＋CD25-T细胞亚群对自身免疫性疾病有很强的抑制功能，说明CD25并非功能性Treg的必须结构［7］。此外，CD4＋CD25＋Treg表面标志物还包括CTLA-4［8］、GITR［9］。CTLA-4单抗和 GITR抗体均能够阻断Treg的免疫抑制功能［7］，但是CTLA-4缺陷小鼠的Treg和GITR-CD4＋CD25＋T对CD4＋CD25-T也有较强的抑制作用，说明这些分子在Treg细胞的免疫抑制功能中发挥重要但非必要作用。和CD25相似，这两种分子不仅表达于Treg也可表达于活化的效应性T淋巴细胞表面。FoxP3基因编码的DNA结合蛋白可以抑制包括生成细胞因子和T细胞增生在内的多种基因的转录［10］。在mRNA和蛋白质水平上，FoxP3都仅表达于CD4＋CD25＋Treg，在CD4＋CD25-T和B淋巴细胞及CD8＋T细胞均无明显表达。在小鼠，FoxP3是Treg的特异性细胞内标志物，因此目前普遍将FoxP3作为鉴别CD4＋CD25＋Treg的首选分子。然而近来的研究发现，在人类，除了Treg一些非T细胞如肿瘤细胞也能够表达FoxP3［11］。最近发现，白细胞介素7（IL-7）受体（CD127）低表达有利于将Treg细胞同活化的T淋巴细胞区分开，它不仅可以分离出CD4＋CD25＋Treg，还能够分离出 CD4＋CD25-T中的 Treg［12］。综上，若联合FoxP3和CD127可能会更加准确地区分出CD4＋CD25＋Treg。

2 Treg细胞水平和疾病状态

到目前为止，在HBV感染不同阶段的Treg水平以及Treg与疾病状态之间是否存在相关性尚无定论。一项大规模的研究显示，慢性HBV携带者外周血单核细胞和肝组织中CD4＋CD25＋FoxP3＋的数量高于感染后恢复者及健康者，并与HBeAg状态相关［13］。另外一项研究检测急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、慢性重型乙型肝炎患者外周血Treg，结果发现重型肝炎患者外周血Treg显著升高［14］。同样，慢性乙型肝炎和慢性重型乙型肝炎患者肝组织内的Treg也升高［14］。另有研究也证实，外周血和肝内的Treg与乙肝病毒核酸（HBV-DNA）及 HBsAg水平显著相关［15-16］。与之相反，Franzese等［17］发现慢性无症状携带者、慢性肝炎患者、自然恢复者以及健康者的Treg频率无明显差别。检测HBV感染的慢／急性肝衰竭患者外周血Treg和辅助性T细胞17（Th17）的数量，结果发现Treg／Th17的比值与肝衰竭预后呈正相关。经过抗病毒治疗后达到持续应答的急性加重的慢性乙型肝炎患者，其Treg基因表达水平及病毒特异的Treg细胞数量均显著增加［18］。另外一项研究显示，恩替卡韦单药抗病毒治疗并抑制了病毒复制之后，Th17数量迅速增加而同时Treg下降［19］。

3 Treg与HBV感染的免疫耐受性

CD4＋CD25＋Treg细胞调节对自身和外来抗原的免疫耐受性，其调节作用可以是病毒特异的。HBV感染慢性化可能与Treg介导的免疫耐受相关，主要通过以下几个途径发挥作用。首先，Treg自身可以分泌TGF-β、IL-10及低水平的γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4），从而介导免疫耐受。其次，Treg细胞抑制效应T细胞的增殖和活化。在转基因小鼠的模型中证实，肝内的FoxP3＋CD4＋Treg细胞数量显著增加能够有效抑制活化T细胞应答［20］；另外，体外实验也证实，CD4＋CD25＋Treg不仅能够抑制CD8＋T细胞增殖，还能够抑制其分泌IFN-γ等免疫应答活性［21］。最后，Treg能够抑制髓样树突状细胞成熟，从而使T细胞的活性减低［1］。

4 Treg向肝脏迁移机制

Treg是如何及时到达炎症或者感染部位发挥其免疫调节功能的呢？Oo等［22］分离慢性肝炎患者肝内的Treg，并检测Treg表面的受体表达情况，发现肝内Treg高表达趋化因子受体4（CCR4）和趋化因子受体3（CXCR3），且显著高于其他受体的表达，并且CCR4和CXCR3在肝内Treg上的表达水平显著高于外周血Treg水平。在体外模型中，分别阻断CXCR3及CCR4以观察其对Treg黏附肝血窦内皮细胞的影响，结果发现只有当CXCR3阻断时，黏附于肝血窦内皮细胞上的Treg数量显著减少，并且分别阻断趋化因子配体9（CXCL9）、趋化因子配体10（CXCL10）、趋化因子配体11（CXCL11）与CXCR3的结合，黏附于肝血窦内皮细胞上的Treg数量亦减少，但是效果没有CXCR3显著。Erhardt等［23］用次致死剂量（5mg／kg）伴刀豆球蛋白（Con A）分别处理野生型（WT）及CXCR3缺陷型（CXCR3-／-）小鼠，后者出现的肝损害显著强于前者，再次用次致死剂量（5mg／kg）Con A处理，结果 WT小鼠表现出对Con A耐受（无或者仅轻微的肝损害），而CXCR3-／-小鼠未耐受；分离已经接受两次Con A处理的 WT及CXCR3-／-小鼠的Treg并分别输给未经处理过的 WT小鼠，然后，再给予（5 mg／kg）Con A处理，结果发现，WT小鼠Treg对Con A诱导的肝损伤有保护作用，并且肝内的CXCR3＋Treg显著多于CXCR3-Treg，充分说明CXCR3介导Treg向肝脏迁移在诱导Con A耐受的过程中发挥重要作用。

体外研究证实，乙肝病毒X蛋白（HBx）以一种剂量依赖的模式促进肝细胞分泌CXCL9和CXCL10［24］。同时，临床报道指出慢性乙型肝炎患者肝内和外周血中的CXCL9及CXCL10表达水平均较健康者升高［25］。因此，乙肝病毒感染后，通过HBx诱导趋化因子CXCL9、CXCL10分泌，趋化Treg向肝脏迁移并发挥其对免疫细胞的抑制效应，从而介导机体对肝炎病毒的免疫耐受。

5 阻断Treg与免疫活化

既然Treg在慢性乙肝免疫耐受过程中发挥主要的作用，那么抑制Treg是否就有望打破免疫耐受呢？将编码IL-12的质粒输入慢性感染土拨鼠肝炎病毒（WHV）的土拨鼠，结果发现所有外周血土拨鼠肝炎病毒核酸（WHV-DNA）小于1010的土拨鼠接受治疗后，均出现持续而显著的外周血及肝内WHV DNA病毒载量下降，并伴随e抗原及表面抗原的消失。肝炎病毒诱导产生趋化因子，与受体CXCR3结合趋化Treg进入肝脏从而介导肝脏免疫耐受。治疗初期，所有土拨鼠肝内的FoxP3＋表达均下降，而4个月后，无应答土拨鼠肝内的FoxP3＋显著反弹，而应答鼠肝内的FoxP3＋则已降至检测线水平以下［26］。这说明，土拨鼠对IL-12无应答可能是由于Treg的免疫抑制作用。Sprengers等［27］观察了聚乙二醇干扰素治疗应答与无应答患者的Treg数量差异发现，治疗开始时应答组与无应答组的Treg无差异，随着治疗的进行无应答患者的Treg数量开始增加，而应答组患者未出现这一情况，这说明Treg可能是干扰素治疗无应答的机制之一。Dikopoulos等［28］给小鼠注射编码 HBsAg的DNA疫苗，肝内CD8＋T增强的同时CD4＋CD25＋Treg向肝脏浸润及迁移增加并抑制CD8＋T反应。Furuichi等［29］将小鼠体内的CD25＋T细胞预先剔除后，注射DNA疫苗能够激起更加强烈的HBV特异T细胞以及记忆性T细胞免疫。因此，如果给予免疫刺激的同时能够抑制Treg细胞功能，可能获得持续的T细胞应答反应从而有利于控制病毒。

6 展 望

Treg的结构和功能还有很多方面需要进一步研究。在乙型肝炎病毒感染后，Treg通过调节免疫反应使机体保持在一个相对稳定的平衡状态，却也导致了病毒的持续存在。Treg的功能，可能使机体进入免疫激活状态，有利于病毒的彻底清除，是抗HBV一个新的潜在治疗靶位。但是，免疫激活后若失去Treg的调节作用，是否会造成机体更加严重的损伤，也是值得思考的问题。

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