黏附因子CD44的活化状态及其在肿瘤靶向治疗中的研究进展＊

侯利丹 综述，高 锋 审校

（上海交通大学附属第六人民医院中心实验室 200233）

CD44（cluster of differentiation 44）指白细胞分化抗原簇第44号，是一类重要的黏附分子，广泛分布于细胞表面，如淋巴细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞等［1］。不同细胞表面CD44与透明质酸（HA）结合活性不同，活化状态存在很大差异。许多正常细胞表面CD44处于相对静止状态，而许多肿瘤细胞表面CD44处于高度活化状态，能与其主要配体HA结合，参与肿瘤的发生、发展及转移等［2-6］。目前，有关CD44活化的调控机制仍未完全阐明，但随着对CD44研究的不断深入，其与肿瘤的关系越来越受关注，特别是以CD44为靶点进行肿瘤靶向治疗已经成为肿瘤研究的焦点［7-9］。本文对CD44分子活化状态及其在肿瘤靶向治疗中的作用综述如下。

1 CD44的结构与生物学功能

CD44基因由一组高度保守的外显子组成，约有50～60 kb，位于人的第11号和小鼠的第2号染色体上［10］。根据其外显子的表达方式不同可分为两型：CD44标准型（CD44s）和CD44变异型（CD44v）。CD44蛋白结构可分为3部分：N-端结构域、跨膜结构域和C-端结构域。N-端结构域含有与HA结合的必须序列，是CD44发挥生物学功能的重要区域，C-端结构域可作为蛋白激酶C的底物被磷酸化，参与信号转导过程，并且通过锚蛋白与细胞骨架相连。CD44蛋白的主要功能可归纳为：（1）作为归巢受体介导淋巴细胞与毛细血管后小静脉中的高柱状内皮细胞结合，促使淋巴细胞穿过血管壁回到淋巴组织；（2）参与淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞及自然杀伤细胞等的激活，在激活过程中，CD44与其主要配体HA或相应抗体结合，作为共刺激分子，能够增强淋巴细胞的功能；（3）参与细胞间的黏附，促进成纤维细胞和淋巴细胞与HA、硫酸软骨素及层粘连蛋白等细胞外基质结合；（4）能与细胞骨架蛋白结合，参与细胞伪足形成，并与细胞的迁移运动有关［11-12］。

2 细胞表面CD44的活化状态

CD44是HA在细胞表面最主要的受体。HA是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的高分子黏多糖，为细胞外基质的主要组成部分，能够与肿瘤细胞表面CD44结合，参与肿瘤的侵袭和转移。但是CD44与HA的结合并不完全是自发的。CD44处于3种不同状态：（1）静止状态，不能与HA结合；（2）可诱导激活状态，CD44需要在特异抗CD44单抗或者激活剂（如佛波酯）的诱导下，才能够被激活，与HA结合；（3）组成性激活状态，不需要任何激活剂，CD44即可以与HA结合［13］。CD44的活化状态主要体现在与其主要配体HA的结合活性上，受到多种因素的影响。研究发现，大部分造血系统细胞表面CD44处于诱导激活状态，不能自发结合HA［14］，如B淋巴细胞和T淋巴细胞，经佛波酯或CD44抗体刺激可使其表面CD44受体活化，与HA结合。Levesque等［4］观察到新鲜分离的人外周血单核细胞和淋巴细胞均不能与HA结合，在体外培养8～16h后，部分单核细胞即可与HA结合，植物血凝素和抗体OKT3刺激可显著提高单核细胞与HA结合活性，而大部分淋巴细胞仍不能与HA结合，提示外周血单核细胞表面CD44处于可诱导激活状态，经诱导可与HA结合，许多淋巴细胞表面CD44处于静止状态，不能与HA结合。许多肿瘤细胞如乳腺癌细胞、肺癌细胞，其表面CD44能自发结合HA，处于组成性激活状态［15-16］。

3 CD44不同活化状态的调控机制

CD44的不同活化状态究竟受何调控，目前仍未完全阐明。研究发现，体外培养后多数单核细胞表达高相对分子质量CD44v，具有活性，而大部分淋巴细胞不表达，处于静止状态，仅少数表达CD44v6的淋巴细胞处于活化状态［17］，表明CD44与HA的结合可能与CD44异构体相关。Perschl等［18］发现CD44细胞质段缺失可使T淋巴瘤细胞丧失与HA结合的活性，但是将细胞质段缺失的CD44通过二硫键结合形成CD44二聚体后，CD44能够与HA结合，表明CD44细胞质段可能参与CD44在细胞膜上的分布，促使CD44在细胞膜上的聚集，诱导其与HA结合，该研究提示CD44在细胞表面的分布变化，可调节其与HA的结合。Katoh等［3］发现中国仓鼠卵巢细胞CD44糖基化缺失株可以结合HA。用糖基化抑制剂处理CD44失活的细胞株，可以使CD44相对分子质量降低并促使其与HA结合，提示CD44过度糖基化可能占据其与HA的结合区域，导致CD44不能与HA结合。Peck等［19］将CD44阴性的人黑色素瘤细胞和鼠T淋巴瘤细胞转染CD44，转染可以引起其与HA结合。但是，Swiss小鼠胚细胞NIH3T3转染CD44后，仍不能结合HA，提示CD44与HA结合同时也受细胞类型的影响［5］。HA与CD44的结合也受到HA状态的影响，有学者认为交联状态的HA可能提高HA与CD44的亲和力［20］。综上所述，CD44与 HA结合主要与 CD44构型［21］、受体分布［18］、糖基化［3，22］等相关，同时也受细胞类型［5］、HA 自身存在状态［20］等调控。

4 肿瘤细胞活化的CD44作为靶点在肿瘤靶向治疗中的应用

许多正常细胞与肿瘤细胞均表达CD44，但其活化状态不尽相同。Tzircotis等［5］检测乳腺癌细胞 MDA-MB-231、MDAMB-468及Swiss小鼠胚细胞NIH3T3表面CD44的表达水平和活性，发现上述细胞均高表达CD44，正常小鼠胚细胞NIH3T3与HA结合活性极低，乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468与HA结合活性很高；Bachar等［23］也证实头颈癌患者肿瘤细胞表面CD44能结合HA，瘤旁正常组织不能与HA结合；本实验室研究发现，正常细胞外周血单个核细胞PBMCs、Swiss小鼠胚细胞NIH3T3、人皮肤原代细胞、小鼠肺成纤维细胞L929、小鼠成骨细胞MC 3T3-E1等正常细胞高表达CD44，但是CD44与HA结合活性极低，处于相对静止状态；人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、MDA-MB-468、Hs578T、BT-549细胞表面也高表达CD44，且CD44与HA结合活性很强，处于高度活化状态，与前人研究结果相符。以上研究提示，CD44在正常细胞上多处于静止状态，不具有与HA结合的活性，在肿瘤细胞上则处于高度活化状态，能够结合HA。

基于CD44在正常细胞和肿瘤细胞表面活化状态差异，提示肿瘤细胞表面高度活化的CD44能够作为理想的靶点分子，用于肿瘤靶向治疗。

目前，已有许多学者以CD44为靶点分子，通过阻断CD44与HA结合从而降低肿瘤转移［24-26］，进行肿瘤靶向治疗。Zawadzki等［27］运用CD44s受体蛋白、CD44v10受体蛋白和CD44单克隆抗体阻断小鼠B16F10黑色素瘤CD44与其配体HA结合，发现在不进行任何其他处理的情况下，CD44s受体蛋白和CD44v10受体蛋白可使肿瘤在肺部的转移量分别降低70%和60%，CD44单克隆抗体也取得了基本相同的效果。

近年来，随着纳米载药系统研究的兴起，纳米颗粒连接靶向分子HA，针对肿瘤表面CD44进行肿瘤靶向治疗取得很大进展。Choi等［28］将HA经过疏水性修饰制作成球形HA纳米颗粒（HA-NPs），HA-NPs中间为疏水核心，可以运载疏水性抗肿瘤药物，用荧光标记HA-NPs，分别作用于高表达CD44的鳞状癌细胞SCC7和正常非洲绿猴肾纤维细胞CV-1，结果显示SCC7可以有效摄取HA-NPs，而CV-1没有明显摄取。将SCC7细胞悬液种入裸鼠背部皮下，构建裸鼠鳞癌模型，尾静脉注射荧光标记的HA-NPs检测其在裸鼠体内的靶向性，结果表明HA-NPs靶向结合癌细胞表面CD44，有效提高其肿瘤部位的浓度。Auzenne等［29］发现HA-PTX对CD44阳性人卵巢癌细胞SKOV-3ip和NMP-1的杀伤活性明显大于单纯PTX，加入过量游离的HA能够阻断这种增强的杀伤活性，提示HA-PTX通过靶向细胞表面CD44，达到增强杀伤靶向细胞的效果。Rivkin等［30］在PTX脂质体上连接HA制得带靶向性的PTX脂质体（PTX-GAGs），为了明确PTX-GAGs是否与肠癌细胞CT-26高表达的CD44结合，将细胞与PTX-GAGs共孵育0.5、6、12h后，加入CD44单克隆抗体检测CD44表达，结果发现0.5h时完全不能检测到细胞CD44表达，6h时约半数细胞可检测到CD44表达，12h时所有细胞均能检测到CD44表达，说明0.5h时PTX-GAGs与CD44结合，占据了CD44全部位点，12h后完全进入细胞，释放了CD44结合位点，证实PTX-GAGs主要依赖与CD44结合，靶向进入细胞。小鼠体内实验也显示，PTX-GAGs主要集中于肿瘤部位，在同样的处理条件下，PTX-GAGs抑瘤效果达市售药泰素的4倍。这种现象不仅局限于肠癌细胞，游离多西环素作用于小鼠肺腺癌细胞D122 1h，药物几乎未进入细胞，不对细胞造成杀伤，而DOX-GAGs处理1h后，细胞内明显呈现药物聚集，说明药物可以通过CD44与HA靶向结合主动进入细胞内，显著提高细胞内药物浓度。Bachar等［23］研究了以HA为靶向分子的丝裂霉素脂质体（MMC-GAGs）对5例头颈癌患者的作用，结果显示肿瘤组织CD44与HA有很高的结合活性，而瘤旁正常细胞CD44基本不结合HA，体外细胞杀伤实验结果也证实MMCGAGs选择性靶向杀伤头颈癌细胞，与PTX相比明显提高杀伤活性，而未杀伤瘤旁正常细胞，证明MMC-GAGs在体内应用时，HA仅与肿瘤细胞表面CD44结合，将药物运输至肿瘤部位，不会杀伤表达CD44的正常细胞，在提高药物疗效的同时也保证了体内用药的安全性。Coradini等［31］将透明质酸丁酸纳米颗粒（HA-But）分别作用于高表达CD44的肝癌细胞HepB3和低表达CD44的肝癌细胞HepG2上，发现HA-But对细胞的抑制率较单纯丁酸提高了10倍左右，在相同条件下HA-But对HepB3的杀伤明显高于 HepG2，但是充分延长作用时间HA-But对低表达CD44的HepG2也有明显杀伤作用，提示HA-But与CD44结合后很快进入细胞，CD44可重新结合HA，保证药物在细胞内的浓度，抑制肿瘤生长。

以上研究表明，肿瘤细胞表面活化状态的CD44是肿瘤治疗的一个理想靶点，运用 HA［26］、CD44单克隆抗体［27］、CD44受体蛋白［27，32］等阻断CD44与HA的结合，可以有效减小肿瘤体积，抑制肿瘤转移；以HA为靶向分子制作药物靶向CD44能够有效提高药物在肿瘤部位的聚集，增加药物的生物利用度，达到靶向治疗肿瘤的效果。

5 展 望

综上所述，CD44以不同的状态广泛分布于各类正常和肿瘤细胞上，特别是活化状态的CD44在肿瘤发生、发展及转移中发挥着重要作用，以肿瘤细胞表面CD44为靶点进行肿瘤的靶向治疗为肿瘤治疗提供了新的方向。但关于CD44与HA结合的调控机制尚不完全清楚，有待进一步深入地研究。

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