一种真菌转化人参皂苷的研究

李小磊,齐 滨,胡 娜,李慧敏,刘 莉

(长春中医药大学,长春130117)

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,在我国的应用已有数千年历史,自古被列为上品,现作为名贵中药材也已闻名全世界。人参皂苷主要存在于五加科人参属植物根、茎、叶或花蕾中[1],是人参的主要活性成分之一,现已分离出的人参皂苷有50多种[2]。药理研究[3-6]表明,人参皂苷具有中枢神经抑制、降低细胞内钙、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注损伤等作用。稀有人参皂苷(如 Rh1、Rh2、Rg3、Rb3等)更为珍贵 ,在某些难治性疾病如肿瘤治疗方面显示独特的疗效。因此,如何获得大量的稀有人参皂苷成为现代药学研究的重点。近年来,利用微生物转化法对人参皂苷进行生物转化制备稀有人参皂苷,取得了不少有意义的成果,对转化机制的研究也取得了一定进展,本实验利用真菌对人参根皂苷成分进行转化,对其中皂苷成分的变化进行研究。

1 实验材料

菌株由所在实验室提供,人参根总皂苷(宏久公司提供),柱层层析硅胶100-200目及300-400目(青岛海洋化工厂分厂),万分之一电子天平(FA2004A,上海精天电子天平),HZQ-F100振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司),手提式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂),电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂),BOXUN/博迅洁净工作台,高效液相色谱仪(agilent technologies 1200),紫外可见分光光度计(TU-1810北京普新通用仪器公司),2f20D暗箱式紫外分析仪,EYELA OSB-2100旋转蒸发仪,硅胶板规格：100 nn×100 mm,厚度：0.20～0.25 mm(青岛海洋化工厂分厂)。

2 实验方法

2.1 皂苷的制备 称取精制后的人参根皂苷10 g溶解于35 mL的甲醇溶液中,在60℃的水浴中搅拌,并且加入15 g硅胶混合均匀,直到混合物颗粒均匀而不腻手,冷却至室温,用活化后的硅胶装柱,用有色笔做标记6段。加入氯仿-甲醇(8∶2)的洗脱剂,洗脱。将每一段用甲醇洗脱,分离收集洗脱液,然后浓缩蒸干,将各段分离出的皂苷在水浴蒸干,并研碎称重。

2.2 紫外测定皂苷的含量

2.2.1 标准品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re标准品1 mg用80%的甲醇溶液定容于1 mL量瓶中,制成浓度为1 mg/mL的标准溶液。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取标准品溶液30、60、90、120、150、180 μ L 分别加入干燥的具塞试管中 ,水浴挥干溶剂,各加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,于60℃恒温水浴加热15 min,取出,流水冷却2 min,加冰醋酸5 mL,摇匀,随行试剂做空白得出标准曲线。

2.2.3 皂苷样品的制备 将样品层、1、2、3、4段(其中5段6段为黄色黏稠液体,初步断定多含糖类物质,故不做含量测定)分别配成1 mg含2 mL样品溶液,分别称取样品溶液150 μ L分别加入干燥的具塞试管中,水浴挥干溶剂,各加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,于60℃恒温水浴加热15 min,取出,流水冷却2 min,加冰醋酸5 mL,摇匀,于550 nm处测定吸收值,计算质量浓度。

2.3 皂苷的薄层层析(TLC)[8]本实验所用展开剂为氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)。结果：一段成分比较单一,糖等杂质含量少,故真菌转化选用的皂苷为一段。

2.4 真菌转化皂苷 转化方法按藏韫霞等[9]的方法略作修改。

2.4.1 培养基的制备 琼脂培养基成分为NaCl 4.5 g/L、蛋白胨12.0 g/L、牛肉浸出粉3.0 g/L和琼脂粉20.5 g/L,其pH值为(7.0±0.2)。无菌操作条件下,将菌株接种于琼脂培养基上,置于30℃恒温培养箱中,培养48 h。种子培养基成分为NaCl 5 g/L、K2HPO 42.5 g/L、胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L和葡萄糖2.5 g/L,其pH值为(7.0±0.5)。无菌操作条件下,将琼脂培养基中孢子挖取1 cm2小块接入种子培养基上,置于转速为150 r/min,30℃的摇床上,培养48 h。

2.4.2 转化反应 将人参根皂苷柱分离实验得到的一段纯化产物作为底物,浓度为8 mg/mL,取孢子液30 mL与底物溶液2 mL混合,反应在100 mL的小三角瓶中进行,将小三角瓶封好后置于空气浴振荡器中130 r/min振荡培养,温度设为 30℃,培养10 d,从0时开始每隔24 h取样1mL,加入300 μ L正丁醇萃取,旋涡混合器上充分混匀后,10 000 r/min离心1 min,取出上层正丁醇相,余下的混合物用300 μ L正丁醇重复萃取1次,合并2次萃取的正丁醇相,在通风橱内55℃水浴浓缩,人参皂苷浓度变大,便于TLC检测(每次取样后直接放到4℃冰箱保存,待5次取样完毕集中接上述步骤处理)。

2.5 HPLC检测

2.5.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18 600Bar(3 mm ×50 mm,1.8 μ m);流动相 ：乙腈(B)-水(A);流速为 1 mL/min;柱温：30 ℃;波长：203 nm;梯度洗脱。

2.5.2 标准品溶液的制备 分别精密称取人参皂苷标准品 Rg3 、Rb1、Rc、Rb2 、Rd 、Rh2 、Compound-K,用色谱甲醇溶解,定容到1 mL的容量瓶中,使其最终浓度为1 mg/mL。

2.5.3 样品溶液的制备 将挥干溶剂后得到的皂苷称取1 mg,分别加色谱甲醇稀释并定容到1 mL的容量瓶中,完全溶解过0.45 ptm微孔滤膜,取滤液,即得1 mg/mL的供试品。各试样注入5 μ L于HPLC色谱仪中,测定峰面积,按外标法计算含量。

3 实验结果

由HPLC法可知转化后皂苷成分中Rb2、Rc质量浓度基本无变化,而从得到的人参皂苷质量浓度变化图中可以看出,筛选出的真菌对二醇型皂苷具有转化活性,Rb1质量浓度明显减少,Rd的质量浓度增多,由此得出结论该真菌能将人参皂苷Rb1转化为Rd。

4 讨论

目前,对于二醇组人参皂苷的转化,通常认为是由糖苷酶水解侧链糖基而得的转化产物。微生物转化法比其他方法更有优势。其成本低,副产物少,确定各种高活性代谢物质的生理代谢途径,筛选可以专一性转化的高产菌种,因此寻找合适的工业生产条件对于大规模工业生产稀有人参皂苷及临床应用具有重大意义。本实验采用真菌半连续转化法转化人参皂苷Rb1,通过对转化后的皂苷含量进行测定,得到该真菌转化人参皂苷的最适条件,为其规模化操作提供一定参考依据。对于本次试验还有待于考察的因素还有很多,如培养基成分对真菌的影响,菌浓度和转化温度对转化皂苷的影响以及菌种的选择等都有待于确定和进一步研究。

[1]Zou K,Zhu S,Meselhy MR,et al.Dammarane-type Saponins from Panax japonicus and their neurite outgrowth activity in SK-N-SH cells[J].J Nat Prod,2002,65(9)：1288-1292.

[2]Cui XM,Jiang ZY,Zeng J,et al.Two new dammarane triterpeneglycosides from the rhizomes of Panax notoginseng[J].J Asian Nat ProdRes,2008,10(9)：845-849.

[3]李学哲,朴惠顺.人参皂苷Rh2含量测定方法及药理作用研究现状[J].延边大学学报：医学版,2009,32(2)：153-156.

[4]王本祥.人参的研究[M].天津：天津科学出版社,2002.

[5]高爽.论人参的成分及人参皂苷的药用价值[J].辽宁经济职业技术学院学报,2008(1)：28.

[6]付建国.人参皂苷微生物转化的研究[D].长春：吉林农业大学,2004.

[7]Wang CZ,Xie JT,Fishbein A,et al.Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng on SW480 human colorectal cancer cells[J].Phytother Res,2009,23(1)：6-13.

[8]章观德,周志华,王慕邹,等.人参的分析：Ⅱ人参皂苷的测定[J].药学学报,1989,15(3)：175-180.

[9]藏韫霞,白龙律,尹成日,等.人参稀有皂苷生物转化菌株的筛选及其鉴定[J].延边大学学报,2009,35(3)：238-242.