瘢痕疙瘩成纤维细胞中有关传导分子mRNA水平的实验研究

弓军胜，冯瑞铮，余睿芳(山西医科大学第一医院整形科，太原 030001;通讯作者，E-mail:frz1121@sina.com)

瘢痕的形成与成纤维细胞内高表达转化生长因子 β(transforming growth factor-beta，TGF-β)信号关系密切［1］。TGF-β/Smads信号通路异常活化，能有效地刺激瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、合成和分泌大量Ⅰ、Ⅲ型胶原，最后导致瘢痕的形成。TGF-β诱导早期基因(TGF-β inducible early gene，TIEG)能够模拟 TGF-β/Smads信号通路的生物学效应，增强TGF-β/Smads的转录因子的调控作用，并且发现TIEG增强Smads信号通路的作用是通过上调Smad2基因转录，抑制Smad7启动子附近特殊的反应元件实现的［2］。

本课题将通过对正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞体外培养的实验研究，对其TGF-β/Smads信号传导通路中有关传导分子 mRNA(如 TIEG、Smad2、Smad7)的表达情况进行比较，并探讨相关意义，为今后临床应用提供一定的理论和实验指导。

1 材料与方法

1.1 材料

瘢痕疙瘩标本取自我院就诊治疗的患者50例。无结缔组织、心、肝、肾、肺等疾患，6个月内未使用类固醇激素类药物、抗肿瘤药物等，且未曾接受放疗。将标本漂洗数次，分别去除上皮，分别切成5块2 mm×2 mm大小的组织块，送入无菌培养瓶中，加入RPMI1640培养液，培养4 h后将培养瓶翻转，另加5 ml培养液及少量胎牛血清继续培养。每3-4 d换液一次。待培养的成纤维细胞长满瓶底后，PBS漂洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代，继续培养［3］。取第5代之内的细胞用于本实验研究。

1.2 方法

1.2.1 细胞总RNA的提取 分别取瘢痕疙瘩与正常皮肤组织的细胞共100例，并将其按Tripure Reagent总RNA分离试剂盒说明进行提取RNA。

1.2.2 提取的总RNA的浓度、纯度测定和完整性分析 用紫外分光光度仪分别测定在260 nm和280 nm波长处的吸光度(OD260和OD280)，通过以下公式计算RNA的浓度:RNA(μg/μl)=OD260×40/1 000×稀释倍数，同时计算 OD260和 OD280的比值(OD260/OD280)，当比值接近于2.0时，说明提取的RNA较纯，可用于后续实验，-70℃保存。利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行完整性的鉴定。

1.2.3 RT-PCR 用总RNA制备cDNA:在2 5 μl反应体系中包括1 μg 待检总 RNA，2 μl Oligo(dT)，5 μl AMV Buffer，5 μl 三 磷 酸 脱 氧 核 糖 核 苷(dNTP)，0.5 μl RNA 酶抑制物，l μl禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶，0.1%焦碳酸二乙酶(DEPC)水13.5 μl，42 ℃水浴1 h 后，5 ℃ 5 min 破坏反转录酶终止反应。冰浴5 min后-70℃保存。

PCR扩增β-actin以及各个目的基因:在50 μl反应体系中包括 2 μl cDNA，5 μl 10 ×Taq Buffer，上游引物、下游引物各 1 μl，4 μl 25 mmol/L MgCl2，8 μl dNTP 的混合物，浓度为 2.5 mmol/L，1 μl Ex Taq DNA 酶(5 U/μl)，28 μl去离子水。具体引物序列见表1。

表1 有关传导分子引物序列Table 1 Sequencing of primers

PCR反应条件如下:94℃ 5 min预变性，随后进行35个循环，94℃ 1 min变性，52-58℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，最后72℃ 10 min充分延伸。反应结束后，取10 μl PCR产物电泳鉴定，以明确扩增产物的数目和大小。

1.2.4 电泳条带的光密度计算和统计学分析 对各电泳条带的光密度定量分析，RT-PCR产物以各组细胞的目的基因与β-actin的光密度比值进行比较，实验数据均以±s表示，实验结果进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

用Tripure提取成纤维细胞总RNA，用变性的甲醛电泳证实了所提取的总RNA的比值约为2∶1，图1中可见其中6个样本清晰的28 s、18 s和5 s三条带，而且28 s与18 s的比值约为2∶1，表明提取的RNA结构完好，无降解。

图1 成纤维细胞提取的RNA凝胶电泳图(从左至右依次为6个样本的电泳带)Figure 1 Gel electrophoresis of extracted RNA in keloid fibroblasts

采用RT-PCR法，从成纤维细胞中扩增出了相应的目的基因cDNA片段。瘢痕疙瘩成纤维细胞组TIEG、Smad2 mRNA表达水平明显高于正常皮肤成纤维细胞组，而Smad7 mRNA表达水平明显低于正常皮肤成纤维细胞组，差异有统计学意义(P＜0.05，见表2及图2)。

表2 瘢痕疙瘩组与正常皮肤组成纤维细胞中各基因mRNA表达水平 (n=100)Table 2 The mRNA levels of TIEG，Smad2，Smad7 in fibroblasts of keloid tissues and normal controls(n=100)

3 讨论

创伤愈合时过度的组织纤维化导致瘢痕疙瘩形成，在此过程中TGF-β与受体的过度表达是一个关键的因素。TGF-β分泌活跃的细胞出现在伤口部位时，可以通过自分泌和旁分泌作用来加强其致纤维化的作用。

TGF-β/Smads信号通路中 TGF-β的生物学效应主要通过细胞内的 Smad蛋白介导［4］，其中受体调节性Smads(Smad2，Smad3)起着正性调节作用，促进瘢痕的形成，抑制性Smad(Smad7)发挥负反馈调节作用［5］，抑制瘢痕的进展。而TGF-β致纤维化的效应主要是通过促进细胞外基质(ECM)合成，抑制ECM降解，最终导致ECM的积聚。

图2 瘢痕疙瘩组与正常皮肤组成纤维细胞中各基因mRNA表达电泳图Figure 2 The mRNA expression of TIEG，Smad2，Smad7 mRNA in fibroblasts of keloid tissues and normal controls by RTPCR

本研究显示瘢痕疙瘩成纤维细胞中，TIEG mRNA水平的表达远高于正常皮肤成纤维细胞，可见TIEG以及TGF-β的过度表达与瘢痕疙瘩发生、发展有密切关系。进一步又分析了Smad蛋白的表达，显示瘢痕疙瘩中表达Smad2 mRNA增强，表达Smad7 mRNA减弱，说明 TIEG能够模拟 TGF-β/Smads信号通路的生物学效应并依赖于 Smad2，TIEG过度表达能下调内源性Smad7并上调Smad2基因转录。

最新研究表明细胞外基质主要成分的基因启动子上存在Smads蛋白的结合位点［6］，一些参与细胞外基质调控如CTGF、α-SMA、Smad7等的基因启动子上亦发现有 Smads蛋白的结合位点［25，26］。TGF-β可通过Smads信号蛋白调节上述靶基因的表达，参与组织纤维化的发生与发展。

［1］ Meran，S;Thomas，DW:Stephens，P，et al.Hyaluronan facilitates transforming growth factor-beta(1)-mediated fibroblast proliferation［J］.J Biol Chem，2008，283:6530.

［2］ 杨娥，邹崎葩，张恒术.DNA甲基转移酶1在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及意义［J］.中华整形外科杂志，2013，29(2):117-120

［3］ Gordon，Kelly J;Blobe，Gerard C.Role of transforming growth factor be to superfamily signaling pathways in human disease［J］.Biochim Biophys Acta，2008，4(1978):197

［4］ 缪泽群，宋韬.TGF-β1调节瘢痕疙瘩成纤维细胞分泌MMP-1及TIMP-1的研究［J］.中国麻风皮肤病杂志，2013，29(6):373-375.

［5］ 弓军胜，兰丽珍，孙辽.载体介导的siRNA抑制TIEG在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达［J］.中国药物与临床，2007，7(2):106-108.

［6］ 刁建升，马显杰.瘢痕疙瘩发病机制和药物治疗研究新进展［J］.中国美容整形外科杂志，2013，24(3):187-189.