复发性流产的遗传因素与同种免疫因素分析

朱庆文 施蔚虹

江苏省南通市妇幼保健院(226006)

复发性流产中有30%～60%胚胎染色体异常，部分由遗传因素引起，部分由环境因素所致［1］。在可识别的流产组织中，特别是妊娠前3个月的流产中，绒毛染色体核型异常的发生率达到50% ～60%［2］。另据报道，复发性流产约有60% ～70%原因不明，目前研究认为与免疫因素有关，是母体排斥胎儿的结果［3，4］。本研究探讨胚胎染色体异常因素和免疫因素在复发性流产中的关系。

1 资料和方法

1.1 对象和分组

1.1.1 一般资料 2009年2月～2011年9月就诊本院的绒毛染色体培养成功的复发性流产患者73例，年龄28.6±5.4岁，流产3.84±1.73次。所有病例均经过详细询问病史及系统检查，具备以下条件:①连续发生2次或以上自然流产，且妊娠时间＜12周;②夫妇双方染色体核型正常;③女方催乳素、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、孕酮、睾酮等测定正常，无内分泌疾病史;④盆腔超声、子宫输卵管造影排除生殖道器质性病变;⑤宫颈分泌物检查排除沙眼衣原体、解脲支原体感染，TORCH检查排除近期感染;⑥自身抗体检测为阴性;⑦男方精液常规检查正常或治疗后恢复正常。

1.1.2 分组 将绒毛染色体培养成功的复发性流产患者73例，按绒毛染色体检查结果分为两组:胚胎染色体核型异常组(35例)，平均年龄29.87岁，其中染色体数目异常31例，结构异常4例;胚胎染色体核型正常组(38例)，平均年龄26.82岁。正常对照组36例，其中有同期就诊本院的正常妊娠妇女14例，检测封闭抗体时妊娠时间＜12周，平均年龄26.32岁，均为首次妊娠，无感染，无染色体、生殖系统解剖结构、内分泌等异常及无自身免疫性疾病史，无先兆流产症状和体征，B超证实胚胎发育正常;22例为同期选取的正常非妊娠妇女，平均年龄29.23岁，既往均有妊娠史，但无自然流产、死胎、死产史，同时排除染色体、生殖系统解剖结构、内分泌的异常和感染等，无自身免疫性疾病。同时设绒毛染色体正常对照组23例，均为人工流产妇女，年龄19～35岁，妊娠时间＜12周，自然受孕，近半年未服用过甾体激素，无并发症及其他合并症的健康妇女，胚胎染色体核型分析正常。

1.2 方法

1.2.1 材料 丝裂霉素C(北京拜尔迪公司);RPMI-1640培养液(美国Sigma公司);重组干扰素(r-INF，100万U/瓶，安徽安科)，用生理盐水配制40万U/ml;胎牛血清(杭州四季青公司);淋巴细胞分离液(上海华精公司)，绒毛组织诱导液组成(按体积百分比):r-IFN 5%，胎牛血清20%，RPMI-1640为75%，均为过滤无菌分装。

1.2.2 培养方法 ①73例绒毛染色体培养成功的复发性流产患者和36例正常对照者采用单向混合淋巴细胞培养测定封闭抗体活性。封闭抗体的检测时间为孕前初诊和孕后的第1次检测。取男女双方外周血各15ml，37℃水浴30min，吸取血浆，用生理盐水对比稀释，缓慢加入装有3ml淋巴细胞分离液的试管中，2 500r/min离心20min，全部吸取中层灰色细胞层，生理盐水离心清洗2次，台盼蓝染色，计数板计数。调整细胞密度为2×106/ml，男女双方各保留1ml，离心，留取沉淀，各加入250μl丝裂霉素(终浓度50mg/L)和1.75ml生理盐水，37℃ 水浴40min，生理盐水离心洗涤2次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640液调整细胞密度为2×106/ml。女方多余的淋巴细胞，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞密度为 2×106个/ml，取0.5ml与男方用丝裂霉素处理的淋巴细胞悬液0.5ml混合，作混合淋巴细胞培养;另取女方用丝裂霉素处理的淋巴细胞悬液0.5ml与0.5ml女方淋巴细胞混合培养作为此次试验的质量控制，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养6d。②73例复发性流产患者的绒毛组织经改良组织块培养后，一部分绒毛细胞留作染色体分析;一部分收获，离心，留取沉淀，加入250μl丝裂霉素(终浓度50mg/L)和1.75ml RPMI-1640，37℃ 水浴 60min，其余处理同血液刺激细胞相同，调整细胞密度为4×106/ml，与等份的绒毛组织诱导液混合，使最终细胞密度为2×106/ml，取0.5ml与0.5ml女方血液淋巴细胞(获取方法同孕前)混合，做混合淋巴细胞培养，置于37℃ 含5%CO2的培养箱内培养6d。

1.2.3 淋巴细胞转化率计算方法 将培养后的细胞涂片、染色，光学显微镜下计数200～300个细胞，计算淋巴母细胞百分率。男女双方混合淋巴细胞培养中的淋巴母细胞百分率与女方对照淋巴母细胞百分率的差，为淋巴细胞转化率。

1.3 统计学方法

所有分析使用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

胚胎染色体核型异常组在孕前、孕早期淋巴细胞转化率低于流产后(P＜0.05);而流产后淋巴细胞转化率高于染色体核型正常组(P＜0.05)。见表1。

3 讨论

研究认为，复发性流产是因母胎之间免疫状态失衡，发生免疫排斥所致，约占总妊娠数的0.5% ～3%［5］。本文73例复发性流产患者中，38例胚胎染色体核型正常组患者孕前、孕早期和绒毛细胞诱导的淋巴细胞转化率均较对照组低，显示这部分患者流产的原因可能源自封闭抗体的缺乏。另35例胚胎染色体异常者，孕前、孕早期的淋巴细胞转化率同样较低，如果无绒毛染色体检测，其流产的原因同样会被归结于封闭抗体的缺乏，从而忽略了另一个重要原因即胚胎染色体异常导致流产。Sullivan等［6］、Carp等［7］提出胎儿染色体异常是复发性流产的原因之一，其研究结果显示在复发性流产组中，胚胎核型为非整倍体的比率为25.4%(31/122)和41%，与本文复发性流产中胚胎染色体异常率为47.9%(35/73)相近。笔者认为复发性流产的病因复杂，仅考虑单一因素是不够全面的，应尽可能覆盖相关因素，以确认流产患者是否同时存在着遗传和同种免疫两种因素。

表1 各组在不同时期采用不同刺激细胞诱导的淋巴细胞转化率(%，)

表1 各组在不同时期采用不同刺激细胞诱导的淋巴细胞转化率(%，)

*与流产后比较P＜0.05 #与胚胎染色体核型异常组比较P＜0.05

组 别 n 男方淋巴细胞作刺激细胞孕前 孕早期绒毛组织作刺激细胞流产后胚胎染色体核型正常组 38 6.89±3.84 8.19±4.17 7.84±3.97#23 - - 22.51±9.43胚胎染色体核型异常组 35 7.94±4.12* 8.78±4.74* 11.37±6.65正常非孕妇女对照组 22 27.24±10.35 - -正常妊娠妇女对照组 14 - 25.37±8.21 -正常绒毛染色体对照组

绒毛组织细胞是胚胎外胚层细胞，具有与胚胎组织相同的遗传性状。混合淋巴细胞培养能揭示两种遗传背景下不同个体的组织相容性。目前，临床上通常用丝裂霉素处理男方淋巴细胞作为刺激细胞，女方淋巴细胞作为反应细胞，通过检测女方反应细胞的增殖抑制程度，评价母体内封闭抗体的水平。在本研究中，用来培养染色体的绒毛成纤维细胞可以被看作是一种非专职抗原提呈细胞(APC)，在r-IFN的作用下，可以表达主要组织相容复合体(MHC)II类分子，混合培养的女方淋巴细胞受不相容的MHC刺激而增殖、母细胞化，代表了胚胎本身刺激母体产生封闭抗体的水平。有报道利用胎盘抗原、蜕膜组织、胎儿皮肤组织作为刺激物，进行单向混合淋巴细胞反应，证明了非淋巴细胞也可用于单向混合淋巴反应的可能［8，9］。本文采用绒毛成纤维细胞作为刺激细胞，检测流产胚胎和母体之间封闭抗体的水平，尚未见其它相关报道。

在本研究中，73例复发性流产的患者被分为胚胎染色体异常组和正常组，明确了染色体异常组流产的主要原因可能是染色体异常。而胚胎染色体正常组不受染色体因素的干扰，便于分析研究。本文胚胎染色体正常组的孕前、孕早期、流产后的淋巴细胞转化率无统计学差异，符合流产的封闭抗体的理论:孕妇对胚胎半同种抗原识别低下和反应性低下，孕期无法产生适当的封闭抗体和保护性抗体，则可使胚胎遭受排斥而流产［10，11］。

本研究发现胚胎染色体异常组的孕前、孕早期与绒毛组织细胞诱导淋巴细胞转化率有差异，说明了在同一病例，父代和子代诱导母体产生封闭抗体的检测结果有可能不同，绒毛细胞刺激的封闭抗体要高于父本的淋巴细胞刺激的封闭抗体;利用男方淋巴细胞作为刺激细胞检测封闭抗体的结果，可能并不能全面反映胚胎诱发母体产生的封闭抗体。胚胎染色体异常组绒毛细胞诱导的淋巴细胞转化率高于正常组的原因分析如下:①由于胚胎染色体异常，从而导致胚胎与母体之间产生较大的不相容性，进而诱发母体产生更多的保护性抗体;②胎儿抗原与父代已处于不同的遗传背景，其诱导母体产生封闭抗体的能力与父代可能会有所不同。本研究中用绒毛细胞作为刺激细胞检测的封闭抗体，可能更接近复发性流产患者封闭抗体的实际水平。

综上所述，遗传和同种免疫异常是复发性流产的两大重要因素，有可能同时存在;遗传因素可能会影响到同种免疫因素，主要在于胚胎染色体异常有可能诱发母体产生更多的封闭抗体，但其作为一种推测，还有待进一步的实验研究。

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