米非司酮对孕酮防护PC12细胞氧糖剥夺损伤的影响*

吴春平，王国红，张 勇，李东亮

（新乡医学院生理学与神经生物学教研室，河南新乡453003）

孕酮（progesterone，PROG）是性腺分泌的甾体激素，现在发现它也可在神经系统生成并影响神经系统结构和功能，被称为神经活性甾体（neuroactive steroid）。本实验室先前已经证明PROG可减轻大鼠脑缺血／再灌注损伤（ischemia／reperfusion injury，IRI）引起的脑水肿，降低血脑屏障通透性，促进脑IRI大鼠的行为恢复［1］。最近本室在体外培养的PC12细胞证明孕酮可减轻氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）对神经元的损伤。然而孕酮的防护作用是通过核受体介导的基因途径，还是通过膜受体介导的非基因途径目前尚不清楚［2］。本文在PC12细胞的OGD损伤模型，观察孕酮核受体拮抗剂米非司酮（mifepristone，MIF）阻断孕酮核受体前后细胞形态、存活率、培养液中葡萄糖含量的变化，探讨核受体介导的基因途径在孕酮抗OGD损伤中所扮演的角色。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株购于上海中科院细胞库。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）购自美国 Invintrogen公司；DMEM培养基（无糖、无酚红）、孕酮、米非司酮和2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-［（phenylamino）carbonyl］-2H-tetrazolium hydroxide（XTT）购于美国 Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒购于上海荣盛生物药业有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司。

1.2 细胞培养和实验分组

PC12细胞采用含10%胎牛血清、100 U／ml苄青霉素和100 U／ml链霉素的DMEM培养基，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱内常规培养，取对数生长期细胞进行实验。实验分5组，正常对照组（normal）：常氧常糖培养；OGD模型组（model）：接种24 h后行OGD处理30min，后复氧复糖培养24 h；PROG组：OGD和复氧复糖期间培养基中含10 nmol／L孕酮，余同 model组；PROG＋MIF组：10μmol／L MIF预处理 30 min后，按PROG组操作进行；MIF组：不行PROG处理，余同PROG＋MIF组。各组按上述处理后进行各指标检测。

1.3 PC12细胞OGD模型制备

参照文献［3］对PC12细胞进行氧糖剥夺处理。细胞培养液更换为无糖无酚红DMEM培养基后，放入低氧舱中，快速充入含95%N2、5%CO2混合气体，低氧舱氧浓度低于1%开始计时，持续低氧30 min，低氧过程中环境温度维持在37℃。

1.4 HE染色观察细胞形态

细胞以5×104cells／ml的密度接种于24孔板中，接种24 h后随机分组并按上述操作行各组处理，倒置显微镜下观察各组细胞形态变化，然后行HE染色。

1.5 XTT法检测细胞活力

细胞以5×104cells／ml的密度接种于96孔板，24 h后随机分组，每组设5复孔，各组行上述处理。XTT检测时，每孔加入预温37℃50μl的XTT工作液，培养箱内继续孵育2 h。然后用ELX-800（Bio-Tek）酶标仪检测各孔吸光度值，测定波长450 nm，参考波长650 nm。计算各组细胞活力（Viability）。计算公式如下：细胞活力＝（实验组吸光度－空白组吸光度）／（对照组吸光度－空白组吸光度）×100%

1.6 台盼蓝拒染试验计数活细胞

各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化30 s，完全培养基终止消化，吹打成的单细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液1∶1混匀，台盼蓝着色的细胞为死细胞，活细胞计数仪计数每毫升细胞悬液中活细胞数（viable count）。

1.7 葡萄糖含量的测定

每孔取10μl培养液，用氧化酶法测定培养基中葡萄糖含量，严格按试剂盒操作流程进行。试验结果的计算方法：葡萄糖（mmol／L）＝样本吸光度（A）／校准吸光度（A）×校准液浓度。

1.8 统计学处理

所有数据以均数±标准差（±s）表示，采用 SPSS 13.0软件进行统计学分析，多组之间显著性检验用单因素方差分析，两两比较均采用LSD检验。

2 结果

2.1 米非司酮对孕酮防护氧糖剥夺PC12细胞形态的影响

倒置镜下normal组PC12细胞多呈梭型或三角形，折光性强，两极伸出较长突起，部分突起可发出分枝并交织成网状；HE染色显示，与normal组相比model组细胞皱缩变圆，折光性下降，突起减少或消失，部分细胞裂解成碎片，细胞密度明显降低，胞质浓缩，胞核固缩呈黑色，细胞边集，中央细胞稀疏。PROG组细胞大部分仍呈梭形，胞体皱缩减轻，仍有细短突起，细胞密度较model组增加。PROG＋MIF组和MIF组的细胞形态和密度与model组相似，表明MIF可阻断孕酮改善OGD细胞形态损伤的作用。

2.2 米非司酮对孕酮防护氧糖剥夺PC12细胞活力的影响

XTT法检测细胞活力结果显示，model组细胞活力明显低于 normal组（P＜0.01），PROG组则显著高于 model组（P＜0.01），PROG＋MIF组和MIF组的细胞活力明显低于PROG组（P＜0.05），而与 model组无显著性差异（P＞0.05）。孕酮可显著提高OGD后PC12细胞活力，具有较好的防护作用，而米非司酮阻断了孕酮91.8%±3.2%的防护作用 （表1）。

2.3 米非司酮对孕酮防护氧糖剥夺PC12活细胞数的影响

Model组的活细胞数明显低于 normal组（P＜0.05）。PROG组的活细胞数较model组显著增多（P＜0.05）。PROG＋MIF组的活细胞数与model组无明显差异（P＞0.05），显著低于孕酮组 （P＜0.05），米非司酮拮抗了孕酮 85.0%±2.6%的作用。MIF组与model组、PROG＋MIF组之间均无显著差异（P＞0.05，表 1）。

2.4 孕酮和米非司酮对氧糖剥夺PC12细胞培养基中葡萄糖含量的影响

Model组细胞培养基中的葡萄糖含量显著高于normal组（P＜0.05）。PROG组明显低于 model组 （P＜0.05）。PROG＋MIF组和MIF组明显高于PROG组 （P＜0.05），与model组相比无明显差异（P＞0.05，表 1）。

Tab.1 Effects of progesterone and mifepristone on cell viability，viable count and glucose content in themedium

3 讨论

传统认为孕酮可通过位于细胞质和核内的受体，刺激基因转录和蛋白质合成，产生基因效应。近年来的研究表明孕酮也可通过膜受体将细胞外信号传递给胞内第二信使，发挥非基因效应。目前虽然在很多物种克隆出孕酮膜受体的cDNA和重组蛋白，然而膜受体的本质到现在还不完全明确。我们前期工作表明孕酮可以增加氧糖剥夺PC12细胞的葡萄糖转运体GLUT3的表达，减少PC12细胞的死亡［4］。但它是通过基因效应，还是通过非基因效应目前并不明了，国内外也少有报道。人工合成的米非司酮（RU486）是孕酮的特异性核受体阻断剂，对孕酮核受体有很高的亲和力，拮抗孕酮的作用很强，常被用于研究甾体激素受体作用机制的工具药［5］。本实验证明PROG组细胞活力显著高出OGD模型组（P＜0.01），而预先用孕酮的核受体阻断剂米非司酮处理则可显著拮抗孕酮的作用，细胞活力下降到model组水平（P＞0.05），米非司酮对孕酮的阻断作用达 91.8%±3.2%。台盼蓝拒染试验计数活细胞结果与XTT检测结果一致，米非司酮可阻断孕酮85.0%±2.6%的作用。用葡萄糖氧化酶法测定培养基中的葡萄糖含量，可间接反映细胞对葡萄糖的消耗情况。结果表明model组培养基中的葡萄糖含量显著增高，PROG组则显著降低，PROG＋MIF组明显升高，表明孕酮减少细胞死亡，增加了葡萄糖的消耗，而这种防护作用被米非司酮所拮抗。上述结果表明孕酮对OGD损伤PC12细胞的防护作用可能主要是通过核受体介导的基因效应实现的。

［1］ 李东亮，赵红岗，王东霞，等.孕酮对脑缺血再灌注大鼠纹状体水、钠、钾及钙含量的影响［J］.中国病理生理杂志，2001，17（10）：1012-1015.

［2］ Kilic F，Kashikar N D，Schmidt R，et al.Caged progesterone：a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone［J］.J Am Chem Soc，2009，131（11）：4027-4030.

［3］ Li H，Hu J，Ma L，et al.Comprehensive study of baicalin down-regulating NOD2 receptor expression of neurons with oxygen-glucose deprivationin vitroand cerebral ischemiareperfusionin vivo［J］.Eur JPharmacol，2010，649（1-3）：92-99.

［4］ 侯志慧，王国红，吴春平，等.孕酮对氧糖剥夺损伤的PC12细胞的防护作用［J］.中国病理生理杂志，2012，28（2）：269-273.

［5］ Butts C L，Shukair SA，Duncan K M，et al.Progesterone inhibitsmature rat dendritic cells in a receptor-mediated fashion［J］.Int Immunol，2007，19（3）：287-296.