大肠埃希菌外膜蛋白F 与细菌耐药性研究进展

崔艳艳，高 洪，严玉霖，赵 汝，卢 琴，李祥峰，邵志勇，臧雅婷

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

大肠埃希菌血清型众多，地域性较强，耐药性突出，感染率较高，严重影响养殖业的发展。目前，对于大肠杆菌病的防治主要是使用抗生素和疫苗，而大肠埃希菌耐药性的产生给其防治带来严峻的考验，同时药物残留又影响猪肉及其他畜禽产品的质量，严重威胁人类健康。因此，大肠埃希菌耐药性受到高度重视，已成为世界范围内普遍关注的问题。

目前，大肠埃希菌耐药机制研究主要集中在外膜通透性改变，形成相应的水解酶，泵系统外排，作用靶位改变，外膜渗透压的减小以及形成生物被膜等。近年来已有研究证实OmpF可以引起耐药性，但是这种耐药机制的形成目前尚不是很清楚。本文就OmpF结构、调控系统、转录因子等引起的耐药性进行以下探讨。

1 大肠埃希菌耐药现状

大肠杆菌病发病率在畜禽细菌性疾病中居第一，大肠埃希菌对各种抗生素如β－内酰胺类、四环素类、氯霉素、氨基糖苷类、亲水的氟喹诺酮类等出现严重的多重耐药性，导致严重感染后出现致死病例。目前，对于大肠埃希菌耐药机制研究可知其耐药机制主要表现在抗菌药物作用位点的改变或新作用位点的产生，酶对抗菌药物的修饰或破坏，减少抗菌药物向菌体内的摄入，增加抗菌药物从菌体向细胞外的主动外排作用。研究表明大肠埃希菌外膜蛋白可以通过改变外膜通透性来影响耐药性，在耐药过程中起重要作用。大肠埃希菌外膜蛋白缺失和突变对银纳米抗菌剂抵抗力比野生菌株提高4倍～8倍［1］。有研究［2］构建了双重突变型（OmpC，OmpF缺失）菌株，证明了OmpF的丢失是大肠埃希菌对β－内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类药物产生耐药性的原因之一。瑞普公司研发中心药敏试验发现，近几年在临床上常用抗菌药物中80%已对大肠埃希菌产生严重的耐药性，处于被淘汰的境地。所以，大肠埃希菌的耐药性问题是一个亟待解决的问题。

2 外膜蛋白与抗生素的耐药性

在正常生理条件下，大肠埃希菌外膜通道不仅对于环境中的pH有敏感性的功能，还对于环境中的渗透压有调节功能。大肠埃希菌细胞外膜上的某些特殊外膜蛋白，如OmpF是一种外膜孔道蛋白（porin），也是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性扩散通道。大肠埃希菌的外膜孔道蛋白是某些抗生素进入细胞发挥杀菌作用的必经之路，所以大肠埃希菌外膜蛋白的结构及调控孔道蛋白表达因素的改变都会引起耐药性。

2.1 OmpF结构及与耐药性的关系

抗菌药物只有跨膜进入细菌内到达靶位才能发挥杀菌作用，革兰阴性菌独特的外膜结构，可以抵抗宿主防御因子及许多有效抗生素，这是因为特殊的结构可对物质的大小、电荷、空间位置都有选择性，而膜孔蛋白构成的通道就是决定这种选择性的关键。

大肠埃希菌外膜孔道蛋白OmpF是大肠埃希菌外膜蛋白中的两个亲水性的非特异性孔道蛋白（porin）之一。有研究用X射线晶体照相技术探明膜孔蛋白（porin）ompf为β－折叠三聚体结构，有较宽的开口和出口，中间为较窄的限制部分，合成是由OmpB3基因控制的，而调节基因OmpB由OmpR和EnvZ两个基因所组成［3］。Bredin J等［4］研究发现，外膜孔道蛋白OmpF中L3环暴露在细胞表面，折叠在β－桶内部，形成类似环面的狭窄的区带。L3环的这种特殊结构决定OmpF孔蛋白的离子通道大小，及静电学特征。还有研究［5］发现OmpFL3环中酸性氨基酸D113和E117对于OmpF蛋白的离子电导、离子选择起重要作用。这些特殊的结构都与大肠埃希菌素A、精氨酸和抗生素进入细胞内有直接的关系。许多疏水性抗生素大多经过OmpF通道，所以大多耐疏水性的抗生素如β－内酰胺类抗生素的菌株的孔蛋白 OmpF缺失［6］。研究发现［7］，在细胞内OmpF结合位点中心D113位点处，Mg2＋对于天冬氨酸有很高的结合性。所以在Mg2＋参与下能够改变电荷，并能使恩诺沙星通过孔腔内具有第一羧基可变区狭窄的限制部分进入细胞。

2.2 OmpF生理功能与耐药性关系

外膜蛋白F的这种特殊的结构影响着其生理功能，这种生理功能与孔蛋白引起的耐药性有着直接的关系。外膜蛋白本身有调节外膜通透性的功能［8－9］，带有不同电荷分子进出细胞是通过外膜蛋白F的扩散，三聚体结构间的相互作用是通过脂质间相互作用介导的，而不是蛋白质间的作用，其中有序的脂质链存在于接近孔蛋白表面带正荷的区域，这些正电荷区域可以形成电场对进入孔道内的离子进行偏转，阻碍某些抗生素进入细胞［10］。外膜蛋白通过电场的偏转与孔道蛋白本身的阻塞阻止抗生素进入细菌细胞内，是两个不同的机制。有研究［11］用分子动力学模拟表明在孔蛋白孔腔内较窄的限制部分存在横向静电场的偏转，这个电场可以降低头孢噻肟通过孔道。外膜蛋白F孔道的孔腔内溶剂有很高的亲和力，可以加快抗生素流入细胞内速度，并伴随有水溶性蛋白质氢键的生成，孔道内不能溶解的抗生素的快速流出是因为蛋白孔内溶剂的缺失［12］。还有研究证实［13］OmpF本身是一种选择性的运输蛋白，不仅运输离子和蛋白质毒素进出细胞，还可以运输YebF蛋白家族进出细胞。在酸性条件下，通过OmpF通道对精氨酸、赖氨酸和它们的脱羧基产物的运输对于大肠埃希菌的生存也是必不可少的。由以上可知，孔道蛋白特殊的生理功能，腔内特殊的电场和腔内溶剂的存在及孔道蛋白本身的选择性的运输功能，都与耐药性有直接的关系。

2.3 OmpF二元调控系统与耐药性的关系

戎建荣等［14］证明大肠埃希菌连续使用抗生素将导致OmpF低表达或者不表达，使细胞膜通透性降低，即增加细菌对抗菌药物的耐药性。而二元调控系统EnvZ／OmpR和CpxA／CpxR的调控可以精细调控OmpF的表达变化，从而调节细胞通透性以适应不同的环境，其中包括抗生素环境［15］。EnvZ或CpxA编码的蛋白是外膜上的一种受体蛋白，它先感受环境中渗透压的变化，再将此信息传递给细胞质内的反应调节蛋白OmpR或CpxR蛋白。这两个双组分调控系统机制相似，EnvZ或CpxA感受环境变化，EnvZ或CpxA发生磷酸化，再将信号（磷酸基团）传递给OmpR或CpxR，OmpR或CpxR然后调节OmpF孔蛋白表达降低，OmpF在外膜上形成通道减少，从而导致通透性降低，形成耐药。孔道蛋白OmpF形成的通道可以使小分子质量亲水性物质进入细胞内。许多抗生素都是经过此通道进入细胞达到作用靶位，发挥杀菌作用的。显然，EnvZ／OmpR和CpxA／CpxR二元调控系统在大肠埃希菌耐药中起着重要的作用。

2.4 OmpF的转录因子SoxR与耐药性关系

有研究发现经甲基紫精诱导后的大肠埃希菌，对许多抗生素的抗性表现出一定程度的增强［16］。有人认为这种抗性的普遍增强与SoxR激活micF的转录有关。转录因子SoxR是典型的汞抗性操纵子调节因子家族的成员，感受胞内氧化还原电势，通过铁硫簇失去一个电子，而激活目标基因的表达。micF是反义RNA，与大肠埃希菌外膜蛋白基因OmpF同源性极高。转录因子SoxR错把micF当成大肠埃希菌外膜蛋白F的mRNA进行激活，而大肠埃希菌外膜蛋白F的mRNA发生转录后基因沉默，而使OmpF合成减少，细胞通透性降低［17］，从而阻止抗生素进入细胞发挥杀菌作用。另外，有研究［18］构建 OmpR、EnvZ、CpxA和CpxR基因缺失菌株并用萘啶酮酸、金霉素来研究OmpC和OmpF和二元调控系统（TCSs）的关系，结论是ATP上调与下调同时伴随OmpF对滥用金霉素和萘啶酮酸相应的低表达和高表达。ATP的变化是受CpxR调控的，而OmpC与OmpF孔蛋白合成与通透性改变时都需要能量ATP供应，因此转录因子的转录，二元调控系统的调控与耐药性都是有直接关系的，它们的改变都可以影响到外膜孔蛋白的变化，影响细菌外膜通透性，从而影响大肠埃希菌的耐药性。

3 小结与展望

近年来，大肠埃希菌耐药性受到研究者的高度重视，耐药性的产生不仅给大肠埃希菌病防治带来严峻的考验，也给畜牧业的生产和医疗卫生事业带来了严重的危害。通过对大肠埃希菌外膜蛋白F引起耐药水平提高的研究可知，OmpF表达降低或者OmpF缺失可使菌体外膜通透性降低，从而阻碍抗生素进入细胞产生耐药性。因此，可以从改变外膜蛋白F结构，调控系统，转录因子等方面与耐药性关系入手，改变外膜蛋白F组成与数量、调控系统及转录因子等开发膜通透剂，破坏外膜渗透屏障，使大部分抗生素顺利进入细胞达到靶位发挥杀菌作用，这将为解决大肠埃希菌对抗生素的耐药性问题提供新的思路。

［1］ Radzig M A，Nadtochenko V A.Antibacterial effects of silver nanoparticles on gram－negative bacteria：Influence on the growth and biofilms formation，mechanisms of action［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2012，102：300－306.

［2］ Beceiro A，Maharjan S，Gaulton T，et a1.False extended－spectrum ｛beta｝－lactamase phenotype in clinical isolates of Escherichia coli associated with increased expression of OXA－1or TEM－1penicillinases and loss of porins［J］.Antimicrob Chemother，2011，66（9）：2006－2010.

［3］ Alfredo G T，Li Y G，Christopher B，et al.Outer membrane protein A of E.coli O157：H7stimulates dendritic cell activation［J］.Inf Immun，2006，74（5）：2676－2677.

［4］ Bredin J.Colicim，spermine and cephalosporins：a competitive interaction with the OmpF eyele［J］.Biochem J，2003，376（Pt 1）：245－252.

［5］ 赵志平，聂 鑫.大肠杆菌外膜蛋白OmpF结构研究进展［J］.四川理工学院学报，2012，25（1）：6－9.

［6］ Phale P S，Philippsen A，Widmer C，et a1.Role of charged residues at the OmpF pofin channel constrition probed by mutagenesis and simulation［J］.Biochemistry，2001，40（21）：631－632.

［7］ Singh P R，Ceccarelli M，Lovelle M，et al.Antibiotic permeation across the OmpF channel：modulation of the affinity site in the presence of magnesium［J］.J Phys Chem B ，2012，116（15）：4433－4438.

［8］ Alcaraz A，Queralt－Martín M.Increased salt concentration promotes competitive block of OmpF channel by protons［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1818（11）：2777－2782.

［9］ Ziervogel B K，Roux B.The binding of antibiotics in OmpF porin structure［J］.Structure，2013 ，21（1）：76－87.

［10］ Efremov R G，Sazanov L A.Structure of Escherichia coli OmpF porin from lipidic mesophase［J］.J Struct Biol，2012，178（3）：311－318.

［11］ Faraudo J，Calero C，Aguilella－Arzo M.Ionic partition and transport in multi－ionic channels：a molecular dynamics simulation study of the OmpF bacterial porin［J］.Biophys J，2010，99（7）：2107－2115.

［12］ Bekhit A，Fukamachi T，Saito H，et al.The role of OmpC and OmpF in acidic resistance in E.coli［J］.Biol Pharm Bull，2011，34（3）：330－334.

［13］ Prehna G，Zhang G，Gong X，et al.A protein export pathway involving E.coli porins［J］.Structure，2012，20（7）：1154－66.

［14］ 戎建荣，王淑峰.外膜孔道蛋白OmpC、OmpF的表达与大肠埃希菌耐药的相关性研究［J］.中华医院感染学杂志，2009，19（6）：621－624.

［15］ 郝艳华，张 伟，陈 明.细菌双组分系统的研究进展［J］.中国农业科技导报，2012，14（2）：67－72.

［16］ Amabilecuevas C F，Demple B.Molecular characterization of the soxRS genes of E.coli－two genes control a superoxide stress regulon［J］.Nucleic Acids Res，1991，19（16）：4479－4484.

［17］ 邓名荣，朱红惠，郭 俊.转录因子SoxR的结构、调控机制及生理功能［J］.微生物学报，2010，50（12）：1575－1582.

［18］ Lin X，Wang C，Guo C，et al.Differential regulation of OmpC and OmpF by AtpB in E.coli exposed to nalidixic acid and chlortetracycline［J］.Proteomics，2012，75（18）：5898－5910.