病毒载体介导的椎间盘退变生物治疗的最新进展

赵哲夫，吴小涛，王运涛

(东南大学附属中大医院骨科，江苏南京 210009)

下腰痛(low back pain，LBP)已经成为严重影响患者生活质量的主要原因之一。它不仅使许多人丧失了劳动能力，而且给许多国家带来了巨大的医疗负担，在美国，平均每名下腰痛患者一年所需要的治疗费用约为13 015 美元[1]。现今的研究[2-3]已表明，下腰痛的成因与腰椎间盘退变是息息相关的。目前针对椎间盘退变(intervertebral disk degeneration，IDD)的治疗手段以保守治疗及手术治疗为主，但这些方法在缓解临床症状的同时，无法从根本上阻止椎间盘的生物学退变，甚至会造成邻近腰椎节段加速退变的后果。随着近些年在分子生物学、细胞生物学等领域对于椎间盘退变相关的病理生理过程的研究越来越深入，国内外学者开始寻求一种生物学治疗方法去延缓甚至逆转椎间盘退变。作者就目前病毒载体介导的椎间盘生物治疗研究现状及进展作一综述。

1 椎间盘的生物学特性及退变机制

椎间盘在形态学上由髓核、纤维环、上下软骨终板三部分构成，主要成分为水分、胶原蛋白多糖等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。中央的髓核是富含大量蛋白多糖的胶冻样基质，它不仅含有大量水分，而且利用渗透压梯度将椎间盘外周的营养物质扩散到髓核中心的细胞。髓核外周包围的同心圆排列的纤维环是由浓密的纤维组织构成，富含胶原成分，内层纤维环以抗压力的Ⅱ型胶原为主，外层纤维环以抗张力的Ⅰ型胶原为主。在椎间盘承受压力时发挥重要的生物力学作用。软骨终板位于椎体上下表面与椎间盘髓核、纤维环之间，在生物力学、椎间盘营养等方面亦发挥不可或缺的作用。

退变的椎间盘最普遍的特点在于打破了椎间盘内细胞外基质的修复与日益加剧的退变进程之间的平衡[4]。随着这种失平衡的进展，退变椎间盘逐渐出现了生物学方面的改变，如纤维环与髓核部分细胞结构改变、细胞密度增加的同时活性下降[5]、椎间盘细胞衰老[6-7]、凋亡加剧[5]，以及分解代谢中所涉及的基质金属蛋白酶与聚蛋白多糖酶等活性上升、细胞因子表达增加[5-8]。这些改变都导致了髓核区域的蛋白多糖和水分进一步丢失，取而代之的是增生的纤维组织、剥脱的纤维环、狭窄的椎体间隙和椎间盘生物力学作用的丧失[9]。虽然椎间盘退变的机制至今仍未完全清楚，但退变过程中涉及的多种基因及生物力学因素已逐渐清晰，再结合椎间盘的组织特性:(1)全身最大无血管组织;(2)上下终板与纤维环组成的密闭框架，于是病毒载体介导的椎间盘退变生物治疗应运而生。

2 病毒载体的选择

为了使目的基因在特定的靶细胞上高效地表达，载体的选择显得尤为重要。载体可分为非病毒载体和病毒载体，前者的优点是无免疫原性、无致病性、制备简单以及携带外源基因的容量较大，但其转导效率低、目的基因瞬时表达及靶向性限制了其临床应用[10]。病毒载体虽然存在细胞毒作用、免疫原性等安全问题，但通过病毒重组技术可以去除病毒的致病基因，保留其复制与感染能力。这样其高效的转导率、目的基因表达水平高等优点得以突显，也使其在椎间盘退变基因与细胞治疗中得到了广泛的应用。病毒载体又可分为逆转录病毒、慢病毒等可整合入宿主基因组的逆转录型和游离在宿主体内以腺病毒、腺相关病毒为代表的质粒型，后者对有丝分裂不活跃的椎间盘细胞有高效的转染率，所以腺病毒及腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)成为了目前椎间盘退变生物治疗中最热门的病毒载体。与腺病毒相比，腺相关病毒的优点在于:(1)感染率高，免疫原性、细胞毒性较弱[11];(2)宿主范围广[11-12];(3)携带的外源基因能长期表达并可调控。因此，腺相关病毒成为了目前动物实验中应用最广、相对最安全的病毒载体。

3 病毒载体介导的椎间盘退变基因治疗

从1997年Wehling等首先提出椎间盘退变基因治疗以来，全世界许多学者对这项治疗产生了浓厚兴趣。目前运用病毒载体将有治疗潜力的外源性基因，如生长分化因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)等基因导入靶细胞可促进椎间盘细胞外基质的合成、抑制分解代谢，起到逆转椎间盘退变的作用。Wang等[13]利用重组腺相关2型病毒(recombinant adeno-associated virus-2，rAAV2)作为载体，成功将人BMP-7基因转染至犬的髓核细胞，并在第4、7、14天对髓核细胞分泌的蛋白多糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原进行定量分析，证实了BMP-7的表达明显提高了蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生成，而且没有出现腺病毒载体所引起的强烈细胞免疫反应。Leckie等[14]将带有BMP-2和TIMP-1的AAV2注射到纤维环穿刺造成的新西兰大白兔椎间盘退变模型中，在注射后第0、6、12周分别运用MRI检测椎间盘T2信号，12周时进行椎间盘组织学分析，证实治疗组较对照组椎间盘退变明显延缓，治疗组中Ⅱ型胶原的血清标志物端尾肽C迅速升高，效果持续到注射后12周。刘海飞等[15]用rAVV2型病毒作为载体，将TGF-β1基因转染至兔退变椎间盘髓核中，分别于4、8、12周获取髓核细胞检测蛋白多糖变化情况，证实rAVV2型病毒可以高效持久地使hTGF-β1在退变髓核细胞中表达，并明显提高蛋白多糖水平。针对基因治疗中存在的安全隐患，Sowa等[16]报道了一种利用AAV携带绿色荧光蛋白的基因治疗控制系统:AAV-RheoSwitch GFP，在体外实验中，在兔髓核细胞中大量注射AAV载体的控制系统，随后增高对应的活性配体浓度，最后移除配体。通过荧光检测可以证实，利用配体来调控基因表达是可行的。在体内试验中，增加绿色荧光蛋白的表达并没有引起其他特异基因的高表达或在邻近组织中表达。此系统有望大大提升椎间盘退变基因治疗的安全性，为基因治疗早日应用于临床奠定了基础。

4 病毒载体介导的椎间盘退变干细胞治疗

椎间盘生物治疗领域另一热点就是干细胞治疗，其中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已成为了研究的热门。(1)来源广泛，制备简单;(2)多向分化能力强，可诱导分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种细胞;(3)低表达MHC1，不表达MHC2，免疫原性低，不会引起宿主急性免疫反应。然而在干细胞治疗的初期，病毒载体介导的治疗方式只是作为一种示踪方法。通过基因标记使干细胞在椎间盘区域的增殖、迁移、分化变得一目了然。Sakai等[17]报道使用逆转录病毒将绿色荧光蛋白转染至兔自体BMSCs，再移植到兔退变椎间盘中，移植后48周可以通过荧光标记更直观地观察BMSCs增殖与分化情况，证实了BMSCs移植是一种有效的治疗方法。随后国内樊守刚[18]、Chen[19]、Miyamoto[20]均在各自的干细胞治疗椎间盘退变的研究中运用此项示踪技术。随着基因治疗的发展，将TGF-β、BMPs、LMP-1、SOX9等一系列治疗基因修饰骨髓间充质干细胞成了一种新的趋势，其意义在于基因与干细胞联合应用明显提升了椎间盘修复能力。李华壮等[21]利用腺病毒载体在体外对BMSCs进行hTGF-β1基因修饰，再移植到兔退变椎间盘中，12周后，X线结果显示移植组椎间隙狭窄明显抑制，免疫组化提示蛋白多糖、Ⅱ型胶原积聚较对照组明显增多。许运等[22]报道运用慢病毒载体成功使SOX9基因修饰的BMSCs移植到兔退变椎间盘中，并稳定表达治疗基因。除了治疗基因，也有学者利用腺病毒成功转染CXCR4等干细胞定向迁移趋化的调控基因[23]，为进一步调控干细胞的分化、迁移提供了思路。

5 病毒载体在椎间盘退变其他治疗中的运用

2009年日本学者 Suzuki等[24]首先将 RNA干扰技术运用到椎间盘退变的治疗中，由于此项技术可以特异性剔除和关闭特定基因表达。随着椎间盘分解代谢、凋亡、衰老等涉及的基因逐渐明了，此项技术将成为一种有效的治疗椎间盘退变的手段，而其中将可能采用腺病毒或慢病毒，利用病毒的高感染率、高表达特性，更好地展开RNA干扰椎间盘退变。此外，Zhang等[25]用慢病毒转染短发夹RNA沉默纤维环内C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)转录因子来延缓鼠椎间盘退变。

6 存在问题及展望

病毒载体介导的基因及干细胞治疗为从根本上逆转和控制椎间盘退变提供了希望，虽然相关的动物实验十分成功，但是要真正将这些技术应用于临床，仍然存在着以下几点难题:

(1)目前使用的椎间盘退变模型以小动物为主，力学环境大多与人体存在较大差异。虽然Lucas等[26]报道了激光造模能更好地模仿自然的椎间盘退变，但尚无控制动物模型的退变程度的方法，这也为探索干细胞移植最佳治疗窗口提出了难题。

(2)Serigno等[27]曾报道犬类椎间盘退变至少需要106干细胞才可达到治疗效果。陈蕾等[28]报道BMSCs与髓核细胞无接触共培养后，BMSCs分化为髓核样细胞，在共培养15 d后，Ⅱ型胶原和蛋白多糖才保持稳定水平。Wallach等[29]报道过高浓度的携带TGF-β1的腺病毒注射入兔椎间盘退变模型造成了双侧后肢末端的麻木。因此，寻找适宜的基因剂量、移植细胞数量及合适的治疗时机发挥最佳的治疗效果也是有待解决的问题之一。

(3)自2003年Sakai报道了动物的干细胞疗法以来，9 年中只有 Yoshikawa 等[30]、Orozco 等[31]、Haufe等[32]3例人体实验报道，而 Vadala等[33]报道泄漏的干细胞造成了兔椎间盘退变模型骨赘形成。Daniel等[34]报道将兔椎间盘外植体在 1 μg·ml－1的 BMP-2或TGF-β3中培养21 d，并没有阻止椎间盘自然退变，但却诱导了纤维环的骨化。同时，病毒载体转染、转录过程中存在促发肿瘤的风险，以致于基因治疗至今未有临床试验报道。这一系列证据表明，明确治疗的长期副作用、提高安全性对于任何一项应用于人体的治疗都是格外关键的。

(4)为达到最佳的椎间盘修复效果，将组织工程学与多种生物学治疗联合运用将是一个崭新的治疗思路。

(5)在基因治疗调控中，应用较多的是四环素调控系统(“Tet-on”系统)，但是否适合应用于椎间盘退变治疗?或者治疗基因有无根据环境自我调控的可能?这些都为未来的病毒载体介导的基因治疗提供了研究方向。而调控干细胞的迁移、分化也处在研究的初期[35]，探索更多有效的调控途径将为安全高效的发挥治疗作用提供积极保障。

相信随着分子生物学的日益发展，病毒介导的椎间盘退变治疗将会逐渐成熟并应用于临床，最终成为从根本上修复或延缓椎间盘退行性变的有效方法。

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