利用微生物制剂提高梗丝品质的研究

2013-03-21陈兴申晓峰巩效伟陈微党立志段焰青

中国烟草学报 2013年3期

陈兴，申晓峰，巩效伟，陈微，党立志，段焰青

红云红河烟草（集团）有限责任公司技术中心，昆明 650202

随着我国卷烟工艺加工技术水平的提高和烟草行业减害降焦工作的持续开展，梗丝在卷烟配方中的应用更加广泛。在配方中加入梗丝后，由于其填充值较高，可以减少卷烟烟丝用量，不仅节约卷烟成本，也可以起到降低卷烟焦油量的作用[1-2]。然而，由于烟梗的主要成分是细胞壁物质，包括大量的木质素、纤维素、半纤维素和果胶，其热裂解产物具有较强的刺激性和杂气，且香气贫乏，吃味平淡，严重影响卷烟的吸味品质[3-4]，致使梗丝在卷烟配方中的掺兑比例一般不大，造成大量烟梗被废弃。

微生物生长过程中，能够通过直接或间接利用某些木质素、纤维素、蛋白质和微量元素等营养源，分解代谢合成出不同种类的生物酶，能够有效促进烟叶中大分子化合物之间的分解和转化，促进致香成分的产生和积累并降低有害成分的含量，从而提高烟叶的抽吸品质[5-8]。利用微生物技术提高烟叶的香气和品质方面已有较多的研究。黄静文等[9]将从烤烟叶面上分离到的短小芽孢杆菌用于烟丝发酵，处理后烟丝的化学成分比例更加协调，处理后的样品烟香提高、烟气更为醇和、刺激性和杂气均有所改善；朱大恒等[10]利用产香菌的发酵产物作为香料来提高烟叶香气，使卷烟品质明显改善。然而，利用微生物直接作用于梗丝，提高梗丝抽吸品质的报道尚不多见[11]。本研究利用产香微生物制剂作用于梗丝，旨在探讨利用微生物制剂提高梗丝抽吸品质的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 梗丝材料

云南烤烟烟梗，红云红河烟草（集团）有限责任公司昆明卷烟厂梗加工车间切丝。

1.1.2 菌种

实验室保存的短小芽孢杆菌V35菌株（Bacillus pumilusVan35），分离至醇化烟叶表面。该菌株目前已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 3411。

1.1.3 培养基

LB培养基：蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加水至1 L。121℃灭菌20 min，用于菌种培养。

1.1.4 试验仪器

Skalar SANPWS 流动分析仪（荷兰Skalar公司）；ABS204-S 电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司）；Cyclotec 1093 旋风式样品磨（瑞典FOSS中国有限公司）；FED可编程热风循环烘箱（德国Binder公司）；R114旋转蒸发仪（瑞士BüCHI公司）；6890N/5975N 气相色谱/质谱联用仪，使用HP-5MS毛细管色谱柱（美国Agilent 公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的培养和微生物制剂的制备

将菌株V35接种于50 mL的LB液体培养基中，37℃、180 r/min振荡培养14 h，获得液体菌种。将液体菌种按0.1 %的接种量接种于200 mL的LB液体培养基中，37℃、180 r/min振荡培养14 h至OD值为2.0。取培养液20 mL，以8000 r/min离心10 min，去上清。用无菌水洗涤沉淀，离心。最后用200 mL无菌水振荡均匀，即为微生物制剂。

1.2.2 梗丝的处理

分别取菌剂5 mL，10 mL，20 mL，不足20 mL则用无菌水补足至20 mL，振荡均匀，即得不同浓度处理液。用小型喷雾器分别将处理液均匀地喷加到100g梗丝上；以喷加无菌水为对照，设置3次重复。将梗丝装入密封袋，并在袋上扎少量小孔。30℃处理48 h后，将温度升至120℃保持20 min，使菌在高温下失活。将梗丝于120℃烘箱中烘干，使水分含量达到11%-13%。

1.2.3 化学成分的测定

按行业标准方法（YC/T159-2002，YC/T160-2002，YC/T161-2002，YC/T 162-2002，YC/T 217-2007）测定样品中可溶性总糖、还原糖、总烟碱、总氮、氯、钾的含量。

1.2.4 细胞壁成分的测定

细胞壁成分的测定方法参照张槐苓等[12]。

1.2.5 致香成分的测定

用GC-MS检测样品中致香成分的含量。GC-MS分析测试条件：毛细管柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 m）；进样口温度：240℃；载气：He，1 mL/min；程序升温：初始温度50℃，保持1 min，以8℃/min升温到160℃，保持2 min，再以8℃/min升温到260℃，保持15 min；进样量：2 μL，分流比：25:1；传输线温度：280℃；电离方式：EI，电离能量：70eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：160℃；质量范围35-455 amu。按此分析测试条件，对挥发性成分进行GC-MS分析，所得图谱经计算机谱库（NIST98，Wiley275）检索，并用内标校正归一化法计算各峰的相对含量。

1.2.6 感官评价

将处理后的梗丝及对照放入恒温恒湿箱中，在温度（22±1）℃、相对湿度（60±2）%平衡48 h，手工卷制成卷烟，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。

1.2.7 数据处理

用SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 V35菌剂处理后梗丝化学成分的变化

按10 mL菌剂/100 g梗丝处理48 h后，对梗丝的化学成分进行了检测并经SPSS软件进行了方差分析，结果见表1。经菌剂处理后，梗丝的多项化学成分发生了显著的变化。经V35菌剂处理后，梗丝的总糖和还原糖含量分别较对照上升了10.19 %、10.68 %，达极显著水平；总氮含量较对照下降了5.70 %，达显著水平；氯离子、钾离子及总烟碱变化不明显。V35菌剂处理后，梗丝的糖氮比和糖碱比分别较对照升高了17.70 %和 8.00 %。

表1 V35菌剂处理对梗丝化学成分含量的影响

2.2 V35菌剂处理对梗丝细胞壁成分的影响

按10 mL菌剂/100 g梗丝处理48 h后，对梗丝的化学成分进行了检测并经SPSS软件进行了方差分析，结果见表2。经菌剂处理后，梗丝的纤维素和果胶含量显著降低，分别较对照下降9.78%、8.06%，总细胞壁物质含量下降6.02%。经SPSS软件进行方差分析可知，纤维素含量及细胞壁物质总量与对照相比差异达显著水平，果胶含量与对照达极显著水平，说明V35处理对于降低烟梗中纤维素、果胶及总细胞壁物质含量效果明显，而对半纤维素和木质素的含量影响不显著。

表2 V35菌剂对梗丝细胞壁成分含量的影响

2.3 V35菌剂处理后梗丝致香成分的变化

按10 mL菌剂/100 g梗丝处理48 h后，通过GC-MS对样品的致香成分的含量和变化进行了检测。烟叶中主要的香气物质有类胡萝卜素降解产物、苯丙氨酸代谢产物、萜烯类化合物、非酶棕色化反应产物几大类[12]。对V35菌剂处理后的香气成分进行了分析，结果如表3所示。

类胡萝卜素是烟叶中重要的香气前体物，烟叶经调制、醇化后95%的类胡萝卜素将分解形成不同的香味物质，对烟叶的香气起着重要的作用[13]。从表3中可以看出，V35菌剂处理后烟梗的类胡萝卜素降解产物含量较对照有所升高，升高幅度为17.95%。烟草中苯丙氨酸的代谢转化是影响烟草香味的重要过程之一，其代谢产物如苯甲醇、苯乙醇都是烟草中的重要致香成分，可使烟草增加类似花香的香味[12]。V35菌剂处理后，梗丝的苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇和苯乙醛均表现出一定的增加，苯丙氨酸类物质总量较对照也有所增加。V35菌剂处理后新植二烯的含量有所升高，萜烯类物质总量也表现为一定程度的升高。糖类和氨基酸的非酶棕色化反应所生成的杂环产物是烟草香气的重要来源之一[14]。V35处理后非酶棕色化反应产物较对照有所增加。用V35菌剂对梗丝进行处理后，香气物质总量增加幅度达到了14.65 %，说明利用微生物菌剂处理有利于增加烟梗总挥发性香气物质的含量。

表3 V35菌剂处理后梗丝致香成分检测结果（μg/g)

2.4 V35菌剂处理后梗丝感官评吸结果

表4 V35菌剂处理对梗丝抽吸品质的影响

对不同浓度V35菌剂处理后的梗丝进行感官评吸，评吸结果见表4。评吸结果表明，经V35处理的梗丝香气特征表现更为突出，烟气刺激性有所改善，评吸排序表明适宜的处理浓度为10 mL菌液/100 g梗丝。

3 讨论

微生物在生长过程中产生生物酶，生物酶能够改变反应底物分子的形状和催化加速底物分子内部某些化学链的断裂，加速底物大分子的降解和某些有害物质的分解，并通过特定微生物的吸收、利用、转化形成一系列有益小分子化合物[15]。于建军等[16]利用果胶酶处理烟叶，结果表明果胶酶能够降低烟叶中果胶含量，而总糖含量则随之升高，利用果胶酶将烟叶中的果胶转化为水溶性糖是提高烟叶质量的有效手段之一。V35处理后，梗丝的总糖和还原糖含量升高，而纤维素和果胶含量有所下降，其原因推测是由于V35菌株在生长过程中产生的一系列酶类具有降解纤维素、果胶等大分子物质为水溶性糖类的作用。微生物对梗丝品质的提升作用是多种因素综合作用的结果，其机理仍需进一步的深入研究。