乳酸菌素研究进展及应用

权自芳，叶 泥，颜其贵，*

(1.四川农业大学动物生物技术中心，四川雅安 625014;2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安 625014)

目前较为普遍接受的观点为绝大多数乳酸菌在次级代谢过程中会合成一种对亲缘性较近的细菌具有抑菌活性的低分子量多肽或蛋白类物质，通称为乳酸菌素，是一类由质粒DNA编码形成的，在细胞溶解时释放并通过专一位点结合而对近缘相关种有致死作用的活性蛋白类物质，产生菌对其乳酸菌素具有自身免疫性［1-7］。乳酸菌素与抗生素同样作为抑菌物质，乳酸菌素有着显著的优点:抗生素是某些微生物通过酶促反应将初级代谢物转变而成，合成过程复杂，难以进行特性和结构改造，而细菌素是由基因编码的，其生物学特性可以通过基因工程等方式进行改造;抗生素长期使用会导致菌株产生耐药性，而细菌素敏感菌株对细菌素不会产生耐药性［8］。目前世界上食品工业中常用的防腐剂以化学合成防腐剂居多，而化学合成防腐剂的抑菌谱有限，另外其致畸性、诱癌性以及易引起食物中毒等问题引起人们的担忧，寻找广谱、安全、高效、经济的天然防腐剂成为食品领域的一个热点，乳酸菌素作为一种无毒副作用的天然食品防腐剂以及比抗生素更具优点的抑菌素，有着广阔的市场前景，得到了各国科研人员的重视。

1 产生菌的选育

发酵特性优良菌株的筛选，包括筛选的材料、方法2个方面的研究。常用的筛选材料有泡菜、新鲜牛奶、动物的肠道、粪便、发酵奶制品、发酵腊肠、生殖系统的分泌物等，目前已经从这些常见材料中筛选得到了大多数产细菌素的细菌［8］。传统筛选法和着眼于细菌素的蛋白质或基因水平的分子筛选法，都只是筛选出自然界中原本就存在的菌株，这些出发菌株大多数存在着效价都比较低、部分生物学特性比较差，因此菌株的改良技术在改变细菌素产生菌的遗传学特性上有着重要作用。

常规的菌株改良技术包括物理因素和化学试剂的诱变，包括紫外线(UV)、氯化锂(LiCl)、N-亚硝基-N-乙基脲烷(NEU)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N离子、60Co、硫酸二乙酯(DES)，以及亚硝基胍等，陈丽园等［9］(13)用紫外线诱变处理产类细菌素的乳酸乳球菌V528，类细菌素效价提高8.48倍，并具有一定遗传稳定性。朱文淼等［10］对抗土壤根癌农杆菌C58采用含有Cef抗生素的培养基进行定向竞争技术筛选和紫外诱变，得到的突变株WJK84-1的抑菌活性提高150%左右。Rollema等［11］通过基因工程得到分别含 H31K和N27K蛋白的编码基因的2个基因改造菌株，在中性酸度条件下溶解2突变菌株所产的NisinZ，其溶解度与原始菌株所产NisinZ比较分别提高大约4倍和7倍。袁静等［12］用含NisZ基因的质粒pHJ201为模板，采用定点突变技术将NisinZ分子中第2位Dhb突变为Dha、B环第8位Thr突变为Ser(T8S)以及第31位His突变为Lys(T2S/H31K)以及将第31位 His突变为 Lys(N27K/H31K)和第27位Asn突变为 Lys，以 pMG36e为载体，电击转化乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9800进行表达，TSS和T2S/H31K的稳定性有明显提高，在pH 9条件下，100℃加热5 min仍不丧失抑菌活性。

2 乳酸菌素生物合成及影响因素

2.1 乳酸菌素生物合成

乳酸菌素是通过核糖体蛋白合成机制，在次级代谢过程中，转录和翻译来合成的。乳酸菌素包括:染色体编码，如Lactacin B、Helveticin J Nisin、Lactacin F 等;质粒编码，如 Diplococcin、Lacticin 481、Pediocins、Sakacin A、Lac-tococcins、Lactocins等;染色体和 rDNA都参与编码，如Camobacterocin BI。大多数革兰阳性菌的乳酸菌素是由质粒基因编码的，与乳酸菌素合成相关的基因组通常还包括乳酸菌素合成基因，和编码在转录调控、翻译后修饰、加工转运到细胞表面和菌株的自我保护性(免疫性)中发挥作用的蛋白产物的其他基因。大部分乳酸菌素是由前体肽产生的，这些前体肽有一个短的N-端前导序列(包括18～24个氨基酸)，在翻译后的修饰中，这个部分被切除掉产生成熟的乳酸菌素［13］。细菌素产生菌在产生细菌素的同时还产生免疫蛋白，因而可以避免细菌素对自身细胞的杀伤作用［8］。

2.2 影响合成得出因素

周围环境以及物理化学因素对乳酸菌素生物合成过程影响很大，其中最主要的是温度和pH。

2.2.1 温度和pH的影响 研究表明，乳酸菌素合成过程与菌株生长是密切相关的，但乳酸菌素合成的最适温度和pH与菌株生长的最适温度和pH并不完全一致。一般情况下，乳酸菌素的最适生产温度和pH低于最适生长的温度和pH，例如，对于Lactobacillus curyatus L442菌株，其生长的最适pH和温度分别是6.0～6.5和30℃，而其生产乳酸菌素的最适pH和温度分别是5.5和25℃。温度对乳酸菌素的生物合成影响较大，温度变化能明显影响乳酸菌素的产量，却对菌株的生长影响较小，例如，Enterococus faecium RZS C5在20℃时要比25～35℃乳酸菌素产量低，经研究表明，温度主要通过影响信息素蛋白的生物合成来影响乳酸菌素的产量。乳酸菌素的生物合成对pH有很强的依赖性，如E.faecium RZS C5，pH恒定在7.5～8.0时，乳酸菌素的合成不受影响，当pH 在5.5～6.5时，E.faecium RZS C5不再发酵产生乳酸菌素［7］。

2.2.2 其他的影响因素 高浓度的盐会抑制乳酸菌的生长以及乳酸菌素的合成，而中等浓度的盐会降低乳酸菌素的合成，培养基成分的改变也会影响乳酸菌素的生物合成，如增加培养基中酵母提取物的含量能够提高E.faecium DPC 1146的乳酸菌素的产量，而增加MRS培养基葡萄糖的含量会提高Lb.amylovorus DCE 471的乳酸菌素的产量［7］。

2.3 乳酸菌素活性的影响因素

乳酸菌素活性可能受多种因素的影响，如乳酸菌素的溶解度和所带电荷的改变、食品中的蛋白酶使乳酸菌素失去活性、与其他化学物质的相互作用、乳酸菌素与食品组分的结合、环境因素的影响使靶细胞膜的结构发生改变。最近的研究表明:乳酸菌素与其他化学物质的相互作用对于乳酸菌素的活性有重要影响，例如在猪肉腊肠中，2%的乳酸钠和Nisin结合相比于Nisin的单独使用对抑制 S.aureus和 Sal.kentucky效果更好［7］。

3 乳酸菌的应用

3.1 在食品方面的应用

3.1.1 在乳制品中的应用 牛奶在生产、贮存和加工过程中容易受到污染。乳酸链球菌素已成功地用于干酪、巴氏灭菌奶、高温处理风味奶、罐藏浓缩牛奶、高温灭菌奶、巴氏灭菌干酪、酸奶等，它能有效抑制毒素产生和肉毒梭菌的生长，延长产品的保质期并使其可在常温下保存。实验证实，用少量乳酸菌素作为佐剂来生产奶油巧克力，消耗可降低80%，37℃只能保存3～7 d的产品，添加乳酸菌素后可以存放21 d，仍能保持原有风味，货架期大幅度延长，鲜奶中加入30～50 IU/mL的乳酸菌素可以使其货架期延长1倍［14］。

3.1.2 在肉制品中的应用 罐装火腿、香肠、熏猪肉、咸猪肉、真空包装的新鲜牛肉等肉制品都使用了乳酸链球菌素。乳酸菌素可抑制杂菌生长，乳杆菌素Sakacin能抑制单核细胞增生的李斯特菌，Nisin能很好地抑制肉毒校状芽胞杆菌的生长。肉细菌属某些乳酸菌所产生的乳酸菌素能抑制肉毒梭菌和革兰阳性细菌，明串珠菌细菌素对李斯特菌、乳球菌、粪肠球菌都有抑制作用。除此之外，乳酸菌素加入肉制品中可降低pH值，较低pH值可减少残留的亚硝酸盐，避免对人的危害，保证肉制加工品安全［14］。

3.1.3 在啤酒及果汁饮料中的应用 Nisin可有效控制啤酒中乳酸菌和片球菌引起的腐败，不影响啤酒的外观和风味，且对于生长和发酵阶段的啤酒酵母活率没有影响，在低pH值、酒花物质的环境，Nisin活性不受影响，且能够有效抑制啤酒中已发现的几乎所有的革兰阳性腐败菌，提高了啤酒的生物稳定性。此外，乳酸菌素还可以避免巴氏杀菌所带来的“老化味”和“杀菌味”，使啤酒保持新鲜度［14］。

3.1.4 乳酸菌素在罐头食品中的应用 乳酸菌素也使用于多种蔬菜如番茄、蘑菇、马铃薯、龙须菜、汤料、豌豆等罐头中，在酸性条件下稳定、易溶、抑菌活性高，能有效阻止抗热微生物的生长，提高罐藏食品的营养价值并使其保持色泽。

3.2 乳酸菌素在医药方面的应用

3.2.1 抑菌作用 抑菌实验表明，乳酸菌素对革兰阴性细菌特别是致病的一些革兰阳性细菌及阴性细菌，如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、单增李斯特菌、福氏志贺氏菌均有不同程度的抑制作用，故可治疗肠炎、胃炎。乳酸菌素可促进胃液分泌，增强胃肠蠕动，促进食物消化［14］。吴桂荣等［15］在乳酸菌素体外抑菌实验的研究中得出乳酸菌素对李斯特杆菌的抑菌浓度为50 mg/mL，金黄色葡萄球菌的抑菌浓度为31.25 mg/mL，对链球菌的抑菌浓度为31.25～50 mg/mL，对大肠埃希菌的抑菌浓度为62.5 mg/mL，对沙门氏菌的抑菌浓度为50～62.5 mg/mL。乳酸菌素经超声波和过滤处理以后，仍然保持对不同菌种的抑菌作用，表明乳酸菌素的抑菌作用是其本身具有的一种特性，而不是依靠活菌起作用［15］。

3.2.2 改善肠道环境 乳酸菌素是多肽物质，在消化道可很快被蛋白水解酶吸收，不会影响肠道内的正常菌体存活，能选择性杀死肠道致病菌，保护和促进有益菌的生长，调节胃肠道菌群平衡，调节肠黏膜电解质、水分平衡，改善肠道微环境［14，16］。

3.2.3 提高免疫力 微生态制剂乳酸菌素可调节免疫，增强机体的特异性与非特异性免疫，激活吞噬细胞酶的活性，选择性杀死肠道致病菌，促进有益菌的生长，刺激肠道产生抗体，增强机体的体液免疫和细胞免疫，提高肠道免疫力［14］。

3.2.4 妇科阴道用药 近年来发现乳酸菌素在妇科用药方面有新的用途。含乳酸菌活菌的阴道用制剂，其代谢产物乳酸和过氧化氢等物质能保持阴道正常酸性环境。乳酸菌可直接补充阴道内正常生理菌群，调节阴道内菌群平衡，抑制或消除阴道中的有害菌的生长［14］。

3.3 乳酸菌素对肉鸡血清生化指标和抗氧化功能的影响

王全溪等［17］在乳酸菌素对肉鸡血清生化指标和抗氧化功能的影响实验证实:饲粮中添加100 mg/kg乳酸菌素可显著提高肉鸡增重，降低料重比，且与饲用抗生素效果相同，饲粮中添加100 mg/kg乳酸菌素肉鸡血清SOD和CAT活性及TAOC显著提高，说明添加一定量的乳酸菌素可显著提高肉鸡抗氧化能力，且以添加100 mg/kg为最佳。陈红梅等研究表明，在断奶仔猪饲粮中添加0.4%乳酸菌素可极显著提高断奶仔猪的日增重，降低粪中大肠埃希菌数，减少腹泻的发生。

4 小结

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们对健康的重视程度也日益加强，无论从食品防腐剂、保鲜剂、抑菌素还是经济动物增肥剂发展的角度来看，纯天然食品防腐、保鲜剂取代或者部分取代化学防腐剂，不产生耐药性且可通过基因工程改造的抑菌素替代原始抗生素，无毒素残留饲料添加剂替代原始饲料添加剂是大势所趋。但乳酸菌素存在自身的缺点，如用量大、效价低、抗菌时效短、抗代谢性能差、抗菌谱窄等不足之处，以及优势菌株选育困难，菌株改造研究还有待加强，然而乳酸菌素可以采用微生物发酵的方法大量生产，同时乳酸菌素种类繁多，随着高产乳酸菌素菌珠的选育和对乳酸菌素抑菌机理的研究深入，乳酸菌素必将得到更加广泛的应用。

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