高Vir毒力根癌农杆菌AGL-1菌株介导丝状真菌转化研究进展和应用

陈 璨，蒋冬花，齐育平，曹丽凌，黄 娜，孙 青

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

丝状真菌(filamentous fungi)是一种重要的微生物，在生物技术领域有着举足轻重的作用。根癌农杆菌介导的T-DNA转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)，是分析基因组功能、了解真菌的重要方法之一，有效率高、转化稳定、操作简单等特点;在ATMT的研究中，有 LBA1100、C58C1、EHA104、AGL-1 等多种根癌农杆菌菌株的应用，对大量研究结论进行统计，能反映不同菌株对转化效率的影响。在近10年丝状真菌转化研究中，对根癌农杆菌被使用的频度、转化效率等综合评价，AGL-1菌株的优势更为显著，为研究丝状真菌提供了更方便的途径。本文就根癌农杆菌AGL-1菌株介导转化真菌种类、机理、方法、影响因素及其应用作综述。

1 AGL-1菌株介导转化丝状真菌的机理

根癌农杆菌是革兰阴性土壤菌，属于根癌菌科(Rhizobiacease)，农杆菌属(Agrobactrium)。能在自然条件下趋化性地侵染双子叶植物的受伤部位，产生冠瘿瘤或发生根。早在1995年，Bundock等就报道利用根癌农杆菌对酵母菌进行了转化，1998年De-Groot等首次报道了农杆菌成功侵染黑曲霉(Aspergillus niger)等6种丝状真菌，开启了农杆菌在真菌转化中的应用。农杆菌侵染丝状真菌与侵染植物相似，Vir基因活性激发，将其所携带的Ti质粒上的一段T-DNA序列转移到植物基因组 DNA 中。需要 VirA、VirB、VirC、VirD1/VirD2、VirE、VirF、VirG、和VirH 等一系列基因协同完成通路。初始由VirA基因编码的蛋白A首先与植物伤口结合，行使感受蛋白功能，释放酚类和糖类物质，受环境刺激后将自身的组氨酸残基磷酸化［1］。修饰后的蛋白A与VirG蛋白结合，将磷酸盐转到G蛋白天冬氨酸残基上，从而激活VirG 蛋白。进而激发 VirB、VirC、VirD、VirE、VirH等一系列基因的表达。VirD1/D2起到DNA松弛酶的作用，将DNA超螺旋解旋为松弛状态，且切开T-DNA边界。VirD2蛋白将T-DNA 5'端切开并与之结合，其自身C-端的细胞核定位信号(Nuclear Localization Signal，NLS)引导 T-DNA 进入植物细胞并进行定位，引导GUS蛋白进入细胞核。VirD蛋白结合在T-DNA右端下游，VirC基因调节VirD蛋白对T-DNA的切割作用。结合蛋白VirE与T-DNA单链形成复合体，VirB介导整段T-DNA通过农杆菌细胞膜整合到植物基因组中，完成转化。有报道称单糖可在整个通路中起到促进VirA和VirG蛋白激活与结合的作用，有研究者在转化红曲霉时发现加入糖类物质反而使转化效率降低甚至不能转化，推测糖类物质可能与转化过程中基因表达有某种未知的作用。综上所述，Vir基因的活性，是侵染真菌的关键，但由于菌株活力不同、侵染对象可能存在特定的机制，都直接影响转化的成功与否，所以Vir毒力高的菌株，在ATMT中，有更高的应用价值。

2 AGL-1菌株介导转化丝状真菌的种类

利用根癌农杆菌转化真菌已有近30年的历史，迄今已经实现了镰刀菌(Fusarium)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)等100余种丝状真菌的转化。AGL-1菌株是根癌农杆菌中重要的成员之一，据报道，通过其转化成功的真菌有紫色红曲霉(Monascus purpureus)，蛹虫草(Cordyceps militaris)，哈茨木霉(Trichoderma hazianum)，侧皮糙耳(Pleurotus ostreatus)等数十种。由于转化效率与农杆菌的菌株种类有着密切联系，因此许多研究者都将多种农杆菌菌株作为实验对象进行比较。其中，Kemppainen等转化菌根真菌(Laccarua vucolor)的结果表明AGL-1菌株的转化效率比LBA1100菌株高4倍。高兴喜等利用AGL-1菌株和LBA4404菌株同时转化木霉，前者成功而后者没有得到转化子。Yanhua Zhang等［2］转化申氏孢子菌丝(Sporothrix schenckii)的实验表明，AGL-1菌株转化效率是EHA105菌株的5倍，是LBA4404菌株的 10余倍。Flowers等同时用AGL-1菌株和C58C1菌株对禾谷刺盘孢菌(Colletotrichun graminicola)进行转化，结果显示 AGL-1菌株的转化效率显著高于C58C1菌株的转化效率。Park等在转化寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)的过程中也发现AGL-1菌株的转化效率明显高于LBA1100菌株。说明AGL-1菌株在转化对象和转化效率上均有着不同程度的优势。

3 AGL-1菌株介导转化丝状真菌的影响因素

3.1 真菌的培养时间

丝状真菌的培养时间对孢子发育起到决定性作用，进而影响根癌农杆菌的侵染。近年来报道的真菌转化实验，大部分设置了培养时间作为转化率的影响因素。蔡琪敏等［3］在利用AGL-1菌株转化红色红曲霉(Monascus ruber)的实验中，将培养时间设置为7～28 d。结果显示红曲在PDA上培养20 d时，有着最高的转化效率;而培养7 d的红曲霉，转化率最低甚至无转化子产生。袁远等利用农杆菌EHA105菌株转化培养8 d的稻瘟病菌，转化率可达每膜(Φ7 cm的滤纸)约50个转化子。刘鹏娟等利用AGL-1菌株转化培养10 d的稻瘟病菌，以硝酸纤维素(NC)膜为转化载体，获得了5 000余株转化子，同时拥有更高的转化效率。黎明等［4］在黑曲霉转化实验中，选用4℃保存15 d和28℃培养3 d的样品，结果显示后者转化率是前者的4.5倍。综合大量文献报道，虽然目前不能指出不同真菌培养时间与转化率互作的机制，但可以明确的是，真菌本身的生长状况良好、发育周期正常是转化成功的前提，转化率的提高很大程度上是使真菌本身能正常繁殖。利用AGL-1菌株转化成功的真菌，均有特定的培养时间和温度，在转化时需要研究者做进一步探究。

3.2 诱导剂乙酰丁香酮浓度

乙酰丁香酮(acetosyingone，AS)在 ATMT中起到诱导农杆菌Vir基因表达的作用。通常以二甲基亚砜(DMSO)溶解，微孔滤膜过滤除菌，用于AGL-1菌株的诱导培养和共培养两个阶段。AS是ATMT过程中必不可少的，如果不使用则无法完成转化。其浓度直接影响转化率，在一定范围内，两者成显著正相关［5］。作为一种酚类化合物，AS浓度过高会对菌体产生伤害，适宜的浓度是保证良好转化率的重要条件之一。刘刚等［6］转化里氏木霉实验中，设置AS为0～800 μmol/L的浓度梯度，结果表明在200～400 μmol/L之间有最高转化率，AS 为0 μmol/L 和800 μmol/L 时没有产生转化子。在众多以AGL-1菌株为转化工具的研究中，AS有效使用浓度一般在50～200 μmol/L，有报道称当AS浓度高于320 μmol/L会对植物和真菌产生伤害，从而影响转化效率。另有研究证明，预培养期间加入AS，在提高转化效率的同时也增加了T-DNA的拷贝数，降低了单拷贝的比例。因此，对于期望得到高比例单拷贝转化子的研究，预培养时期要谨慎使用AS［7］。

早在1984年，Shawch等人的试验表明，农杆菌对酚类化合物具有趋化性，而且这种趋化性依赖于VirA和VirG基因。Melania等利用载体引入高活性的VirG基因，无AS也取得了理想的转化效率。因此陈东亮等认为AS的作用只是诱导Vir基因活性，而与T-DNA转运无关。Turkschj等曾报道过AS受体区域分布在VirA蛋白的第283～304氨基酸区段之间的细胞质区域内。而VirA基因和AS之间的作用方式还不是十分清楚，需要作更深入研究。

3.3 AGL-1菌株与真菌共培养时间和温度

高Vir毒性的AGL-1菌株与真菌共培养时间和温度是重要的条件之一，T-DNA剪切、转移和整合需要一定时间和特定温度条件才能完成。适当延长共培养时间会提高转化率，Yang Ying-qing等［8］在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)转化实验中，共培养时间分别为 12、16、20、24、36 h，其中36 h达到67转化子/皿，为最高的转化效率。郭慧等［9］转化日本曲霉时设置 1、2、3、4、5、6 d 6 个时间梯度，结果显示共培养3 d为最佳培养时间。Leclerque等在球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的转化试验中，共培养时间设置为3 d和4 d，转化效率分别为121个转化子/106个细胞和163个转化子/106个细胞。但过长的培养时间，会造成假阳性的产生、农杆菌生长过密和T-DNA的多拷贝，对挑取和筛选造成麻烦［10］。通过近年来几个研究小组用农杆菌AGL-1菌株转化不同丝状真菌的研究，初步得出AGL-1菌株共培养时间大概在2～3 d。

共培养温度是转化过程中的关键，在保证AGL-1菌株的Vir基因能表达的同时，需要兼顾真菌孢子的生长状况。早期的研究表明，较高的温度不利于农杆菌所携带的T-DNA转入植物和形成肿瘤。郭慧等［9］对日本曲霉的转化实验设置了20、24、28℃，结果表明24℃为最佳。张林平等［11］利用AGL-1菌株转化异角状拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis heterocor－nis)实验中设置了 20、25、30、35℃ 4个梯度，其中25℃有着最高的转化效率。Md.Nazrul Islam 等［12］在尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的转化实验中设置了 20、25、28℃ 3个温度，转化子个数分别为14个/皿、18个/皿、9个/皿。据近年来学者利用AGL-1菌株进行转化的研究，初步得出AGL-1菌株转化丝状真菌的共培养温度与植物相似，在22～25℃左右，过低或过高的温度都不利于Vir基因的表达，有研究表明AGL-1菌株在28℃以上就丧失Vir基因表达的能力。

3.4 AGL-1菌株菌液浓度与真菌孢子数比例

AGL-1菌株菌液浓度与真菌孢子数的比例，对转化率有一定影响。农杆菌浓度较低时，真菌孢子不能与AGL-1菌株充分接触，使转化基数下降。农杆菌浓度过高，AGL-1菌株与真菌孢子接触饱和，但菌量过多、过分繁殖，在共培养基中占用转化子生长资源，甚至农杆菌覆盖长出的转化子，反而使转化率下降，且可能出现转化子无法挑出筛选。孢子量过多也会造成萌发时生长相互接触，连成一片，不利于挑出。所以利用ATMT法进行转化实验时，纯粹追求转化率最高是不现实也是不合理的。丁兴等利用AGL-1菌株转化紫色红曲(Monascus purpureu)孢子过程中，以农杆菌浓度梯度进行实验，结果表明红曲孢子数106个/mL时有较高的转化率，1.35×108个/mL的AGL-1菌株与红曲孢子数106个/mL等体积混合(孢子∶农杆菌=1∶135)，出现最高的转化率每平皿120个，过高或过低的比例均呈转化率下降。刘朋娟等也利用孢子数106个/mL的稻瘟病菌与OD600为0.5～0.6的 AGL-1菌株等体积混合，获得了转化子300个/mL混合菌液的转化率。庄静娜等［13］在利用AGL-1菌株转化紫色红曲时，利用了OD600约为0.5的AGL-1菌株，稀释红曲孢子数约为104，获得了相对较高且适合挑取的转化率。综合近年来利用AGL-1菌株转化丝状真菌的研究，初步可以得出，大部分转化实验中真菌孢子数在104～106/mL，AGL-1菌株在 OD600为0.5左右，2种菌液等体积混合，可以得到较高转化率的同时具有良好的可操作性。

3.5 其他影响因素

真菌分生孢子在大量的转化实验中使用频繁，另外原生质体和菌丝也是利用AGL-1菌株转化的可选材料。不同的材料存在不同的组织结构和生理特性，因此转化方式和转化率也是不同的。原生质体没有细胞壁，因而AGL-1菌株更易侵染，得到更高的效率。但原生质体制备繁琐，分生孢子只用无菌水洗，过滤除去菌丝即可，操作简单。并且有报道称孢子作为材料时，也能取得较理想的转化效率，有的甚至达到原生质体的水平。部分真菌所具有的细胞核，比真核生物的小，且形态变化大，能通过隔膜中的小孔在菌丝中快速移动。因而利用真菌多核菌丝作为材料，可能造成后代的分化，所得转化子不如单核的稳定。Richard等利用预萌发处理的孢子和未经过预萌发处理的孢子转化核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，结果显示两者的转化效率无明显差异，但经过预萌发处理的孢子具有多核，后代遗传稳定性较差。

载体是转化过程中的直接参与者，不同的载体有着不同的空间结构和属性，与参与转化的酶种类和活性有密切联系［14］。Campoy等利用pUR5750载体转化红曲霉的效率是pBGgHg载体的2倍，且利用pBG7-1转化不成功。Godior等利用pBGgHg载体和pBG7-1载体(两者只有启动子不同)进行转化，结果 pBGgHg转化成功，而pBG7-1转化失败。在AGL-1菌株的应用中，王梅娟等［15］构建玉米大斑病菌转化库时，成功使用了双价载体质粒 pBHtl，它将 pCAMBIA1300骨架中的 pCaMV35S-hph置换为 pTrpc-hph。Javier等利用分别含有psk1019载体和pCAM-BIA1300载体的AGL-1菌株介导转化交织顶孢霉(Acremonium implicatum)，发现前者的转化效率是后者的数百倍。目前每种真菌适合的载体并不统一，需要研究人员进行不同尝试。

转化中用于共培养的载体有硝酸纤维素膜(NC)、玻璃纸、杂交膜、滤纸、尼龙膜等。不同的承载膜有不同的通透性，对转化率有一定影响。有研究利用Hybond-N+杂交膜为介质转化致病疫霉(Phytophthora infestans)，其转化效率是用尼龙膜Nytran的2～3倍。另有报道利用玻璃纸和NC膜转化红曲菌，两者转化率无显著差别，但用滤纸则转化率明显下降。

农杆菌诱导培养阶段的IM培养基，和共培养阶段的Co-IM培养基的pH值，将直接影响农杆菌Vir基因的活性。pH值在5.0～5.8比较适合AGL-1菌株Vir基因的表达。Zhuangli Zheng等［16］在利用 AGL-1菌株转化蛹虫草(Cordyceps militaris)的实验中得出，pH值在5.5时有较高的转化率，在5.0和6.0时均呈下降趋势。初步统计近年来的研究，丝状真菌转化中一般pH值在5.2 左右。

4 AGL-1菌株的特性与转化真菌的技术路线

通过上述分析，根癌农杆菌AGL-1是1株具有高Vir基因活性，侵染能力强，适用范围广的菌株。在ATMT法转化真菌的应用中被广泛使用，与其他菌株的比较表现出不同程度的优势。过去近10年的研究里，越来越多的真菌被成功转化，积累了大量的实验数据，为研究其他真菌转化条件提供了参考。经过以上对各种因素的分析，可以了解到其转化技术路线:AGL-1菌株在相应抗性的LB培养基中28℃活化2～3 d，挑取单菌落扩大培养到OD600约为0.15。离心得菌体，加入含有50 ～200 μmol/L AS、pH 值 5.0 ～5.8的 IM培养基，菌悬液培养至OD600约为0.5。以无菌水洗下培养适宜时间的真菌孢子，经4层擦镜纸过滤，去除菌丝及杂质，制成105个/mL左右的孢子悬液。2种悬液等体积混匀，涂布于贴在Co-IM培养基的承载膜上，25℃培养2～4 d。将膜揭下贴于含有头孢霉素和筛选物质的平板上。待转化子长出，挑取单菌到筛选平板上，并转接5～6次，验证遗传稳定性。之后可通过T-DNA上序列设计引物，观察 PCR产物大小，验证 T-DNA的插入。

5 应用和展望

近年来对真菌的研究越来越多，ATMT法本身的技术优势不断表现出来，其应用范围也不断扩大。ATMT法转化效率高、转化子遗传稳定、操作简单、转化原材料多样，在改变菌种遗传特性、功能特性、甚至赋予其本身不具有的功能等方面有着突出的优势。真菌对于保健品、医药、化工、农业等多个领域有着重要意义，而优质工程菌的开发和利用是提高生产效能、产研结合的重要途径［17］。在真菌基因功能的研究方面，基因剔除和定点突变等反向遗传学手段是人们认识基因功能最直接的工具［18-20］。由于Ti质粒中的T-DNA与真菌基因组有同源序列时，会发生同源重组，所以在已知真菌序列的情况下，将目标基因的已知序列克隆在T-DNA上，构建成为打靶载体。携带这种载体的AGL-1菌株在侵染真菌时，会对目标基因进行沉默和更换，使真菌表现型发生变化，从而探索基因功能。在根据表现型寻找功能基因时，AGL-1菌株介导T-DNA随机插入真菌基因组中，构建数量足够的转化库，筛选出表现型改变的转化子。根据T-DNA的已知序列，利用hiTAIL-PCR技术可快速克隆出其左右端功能序列，且效率比过去的TAIL-PCR提高了90%［21］。在培养无选择标记的转基因生物研究中，利用根癌农杆菌可携带不同载体，和T-DNA可在不同位点携带多个基因的特点，将选择标记基因和安全的功能基因同时转化到同一个转化子中。由于2个基因存在于不同位点，通过转化子的分化，筛选出不含标记基因的后代。可得到不影响转基因功能且没有筛选标记的转基因真菌。ATMT法与荧光显色技术相结合，在转化载体中加入荧光蛋白基因，可在植物和真菌存活的情况下，探究蛋白质合成以及追踪相关生理生态活动［22］，也是目前热门的研究方法之一。总之，ATMT法是研究植物和真菌高效、简便的方法，过去的近30年中有着大量的研究成果，并且还会有更大的潜力可以发掘，发挥更重要作用。根癌农杆菌AGL-1菌株是ATMT法中重要的参与者，有着高Vir毒力的特点，在真菌研究中使用广泛，转化高效、稳定，具有较好的应用前景。

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