禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的研究进展

刘宏生，赵 丹，段艳婷

(辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036)

禽流感(Avian influenza virus，AIV)是由A型流感病毒引起的、从呼吸系统病变到全身败血症的高度接触性急性传染病，普遍感染家禽类及鸟类，人类流行病的暴发也深受其威胁［1］。目前，国际上根据AIV致病力的差异，将其分为高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)和低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza，LPAI)［2］。根据世界卫生组织2013年10月8日公布的数据显示，自2003年起全球共发生人感染H5N1禽流感病毒641例，死亡380人，病死率高达59%［3］。A型流感病毒是负链单股RNA病毒，其基因组包括8个负链基因组RNA片段，共编码11个病毒蛋白［4］。NS1 蛋白(non-structural protein 1，NS1)由A型流感病毒基因组中最小的基因节段ns基因编码，在流感病毒的致病性和毒力方面发挥重要作用。

1 NS1蛋白的结构

NSl蛋白作为A型流感病毒重要的非结构蛋白，由流感病毒第8个节段的RNA编码合成，可编码202～237个氨基酸(Amino Acid，aa)，相对分子量约为28 ku。NS1蛋白主要包括2个结构域，即N-末端的RNA结合结构域(RNA-binding domain，RBD)和C-末端的效应结构域(effector domain，ED)［5］。NS1 蛋白大部分氨基酸序列保守，但是RNA结合域和效应域之间的连接区域及羧基末端因毒株不同序列信息有所差异，大多数H5N1(超过90%)第80～84位氨基酸残基缺失［6］。NS1蛋白仅存在于病毒感染的细胞内，感染早期大量存在于细胞核中，感染晚期也可出现于胞浆中，且能刺激机体产生抗NS1蛋白的抗体。蒋培余等［7］制备出H5N1型禽流感病毒NS1蛋白抗体并对其效价进行了初步测评。在2008年12月的《Nature》中，美国贝勒医学院的研究人员利用在2004年越南禽流感爆发期间分离出的一个恶性H5N1禽流感病毒毒株，确定了全长NS1蛋白的结构，显示NS1全长蛋白以一种首尾相接的方式形成1条NS1蛋白长链，其中，RNA结合区与RNA结合区二聚化相连，效应区与效应区二聚化相连。

1.1 RNA结合结构域

NS1的RNA结合结构域由1～73位氨基酸组成，核心区位于第19～38位，能够结合异源RNA，包括病毒基因组 RNA、病毒 mRNA的5'非翻译区、poly(A)RNA 和外源 dsRNA［8］。通过对NS11～73位氨基酸的核磁共振和X射线晶体结构分析发现，该区域以对称的同源二聚体形式存在，每个单体包含3个不同方向的α螺旋:Asn4-Asp24(螺旋1)、Pro31-Leu50(螺旋2)、Ile54-Lys70(螺旋3)，螺旋之间由loop区连接。NS1蛋白的二聚化对其结合dsRNA非常关键，在NS1蛋白和dsRNA结合过程中发挥着重要作用。Cheng等已测定了RBD与dsRNA复合物晶体结构，证实参与dsRNA识别的关键氨基酸残基包括Arg38、Arg35、Arg46 、Thr5、Asp29、Asp34、Ser42 和 Thr49等氨基酸，在结合过程中这几位氨基酸通过形成氢键与RNA双螺旋产生最初的结合。这一结果与通过突变实验得到的NS1 RBD关键氨基酸结果一致［9］。另外，研究者还发现NS1 RBD虽然能与dsRNA相结合，但其只结合规范的A-型dsRNA，而不与 B-型的 dsDNA或 A/B型的 dsRNADNA杂合子结合［10］。另外，在RNA结合结构域中，含有一个非常保守的核定位信号(nuclear localization signal 1，NLSl;34～38位aa)，其氨基酸排列顺序为Asp-Arg-Leu-Arg-Arg，所有的甲型流感病毒均有该保守信号［11］。

1.2 效应结构域

NS1第74位氨基酸至C-末端为效应结构域。晶体X-射线衍射确定其结构也是对称的同源二聚体，形成一种新的蛋白构象—新月折叠。NS1的C-末端效应结构域被认为是NS1与宿主相互作用的主要结构域，其中第134～161位氨基酸为其核心序列，具有阻断宿主mRNA剪接、多聚腺苷酸化和核输出等功能［12］。

Bornholdt和Prasad利用X衍射技术对NS1蛋白效应区的晶体结构进行了分析，指出该区具有一个独特的折叠结构与H5N1亚型AIV的毒力有关。Burgui等指出，NS1蛋白具有eIF4GI(eukaryotic translation initiation factor 4GI)结合区域，作用部位位于第81～113氨基酸之间，可与eIF4GI结合，启动病毒蛋白的合成，提高病毒mRNA的翻译能力。Obenauer等研究发现，NSl蛋白的C端有PDZ结构的结合域，是一种标准的蛋白间相互作用的结构域，在细胞信号转导通路上发挥重要功能，因此PDZ结构域被认为是一种决定流感病毒毒力的重要因子。近来，已有研究证实磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)调节亚基P85β与NS1蛋白存在相互作用，两者互作能够导致PI3K激活，并揭示相互作用的位点是NS1蛋白的效应区以及P85β蛋白的SH2和SH3区域，指出 NS1的89位Tyr残基和164位Pro残基是与P85β蛋白相互作用的关键位点［13］。此外，在促进NS1蛋白二聚体形成并巩固其二聚体结构方面，效应区也发挥着重要的作用。

2 NS1蛋白的功能

NS1蛋白是一种多功能调节蛋白，分别从病毒和宿主两个方面共同调节病毒的致病性及毒力。在病毒方面，NS1蛋白通过增强病毒mRNA翻译从而提高病毒的复制效率，直接增强AIV抵抗宿主的抗病毒反应的能力。在宿主方面，NS1蛋白通过抑制宿主细胞蛋白的合成、诱导细胞凋亡以及拮抗干扰素的产生等方式来调节机体的抗病毒反应，间接地发挥增强病毒致病性的功能。

2.1 调节流感病毒的致病性及毒力

2.1.1 NS1蛋白对宿主细胞蛋白合成具有抑制作用 NS1蛋白可对宿主细胞RNA转录后的加工和转运等修饰产生直接影响。如抑制宿主mRNA多聚腺苷酸化，阻断剪接和细胞mRNA核转运，从而抑制细胞蛋白表达［14］。NS1羧基末端的效应区抑制细胞核mRNA的核输出的同时还提高细胞的前mRNA在细胞核内的浓度，延长细胞核内前mRNA的寿命。病毒的帽依赖性内切酶能从细胞前mRNA上将多聚腺苷酸帽子切下作为合成病毒RNA的引物。

2.1.2 NS1蛋白对宿主细胞凋亡产生影响 NS1蛋白具有诱导和抑制细胞凋亡的双重作用。NS1蛋白主要通过早期抑制细胞凋亡、晚期促进细胞凋亡来实现对感染后细胞凋亡的调控作用。研究发现，NS1蛋白通过与p53蛋白相互作用，抑制p53蛋白调节转录的同时抑制宿主凋亡［15］。流感病毒侵染细胞后，PI3K/Akt信号通路可以通过不同方式被激活:病毒NS1蛋白通过与宿主细胞内蛋白相互作用激活 PI3K/Akt通路［16］;NS1蛋白也可以直接与 Akt相互作用激活 PI3K/Akt通路［17］。但是，NS1蛋白与PI3K的亚基P85β相互作用是激发PI3K/Akt信号通路重要的机制［18］，并有研究进一步确定了NS1与P85β相互作用的区域是NS1效应结构域与P85β蛋白的SH2和SH3区域，同时发现NS1蛋白第89位Tyr残基和第164位Pro残基是与P85β蛋白相互作用的关键位点［13］。

2.1.3 NS1蛋白具有拮抗干扰素及肿瘤坏死因子的作用 研究发现H5N1 NS1蛋白F103L、M106I两个突变，每一突变均能提高病毒毒力增加致死率，提高对IFN-β的转录抑制以增强对干扰素的拮抗作用［19］。NSl蛋白 C端上还存在CPSF30和PABⅡ的结合位点，NS1效应结构域通过与CPSF30、PABⅡ结合影响细胞内前体RNA 3'-末端加工从而抑制细胞产生mRNA，并阻止这些前体mRNA的核输出，抑制宿主细胞mRNA的加工成熟，最终降低IFN-β的表达水平［20］。

2.1.4 NS1蛋白有利于病毒的合成 NS1作为一个重要的转录后调控因子，NS1蛋白通过与宿主细胞因子相互作用，一方面抑制了宿主细胞核内mRNA的剪接和出核，从而抑制了宿主抗病毒因子的表达;另一方面，这种抑制作用也大大提高了前体mRNA在细胞核内的浓度。由于病毒的帽依赖性内切酶能从宿主细胞前体mRNA上将多聚腺苷酸帽子切下作为合成病毒RNA的引物，所以宿主细胞前体mRNA在细胞核内的积累有利于病毒mRNA的合成。NS1蛋白的这种功能对于减少细胞RNA和病毒RNA在利用细胞翻译系统的竞争中是有益的［21］。

2.2 NS1蛋白与宿主细胞内的多种蛋白质相互作用

作为病毒的致病因子，流感病毒NS1蛋白在细胞内可与多种宿主蛋白相互作用，通过增强病毒蛋白的表达或者改变宿主蛋白的重新分布等方式，从而增强病毒的致病性和毒力。目前国际上对与NS1相互作用的蛋白已有报道:这些蛋白主要包括人核仁磷酸化蛋白(NOLC1)、Staufen蛋白、真核生物翻译起始因子4GI(eIF4GI)、NS1结合因子(NS1-I)、Ploy(A)结合蛋白 I(PAPB I)、P85β蛋白。刘宏生等［22］实验证明 NS1蛋白与NOLC1相互作用，并证明相互作用主要是NS1的效应结构域。Falcon A等［23］证实 NS1蛋白与Staufen蛋白具有特异性相互作用，二者的结合使病毒mRNA定位于恰当位置，从而利于病毒蛋白的合成。Tomas等［24］实验表明 NS1蛋白可与eIF4GI相互作用，使eIF4GI与病毒mRNA 5'-UTR特异性结合，竞争宿主mRNA的翻译起始，从而利于病毒mRNA的优先翻译。NS1蛋白还可与PAPB I和eIF4GI三者结合，形成翻译起始复合物使病毒mRNA的5'端更有效地游走于核糖体，促进病毒mRNA的翻译。H5N1流感病毒NS1 PDZ结构结合域的ESEV-ESKV+F138Y能导致小鼠系统感染并提高致死率，单独的突变对毒力影响较小。NS1138位氨基酸不仅影响PI3K/AKT信号通路，还影响NS1与细胞PDZ结构蛋白的相互作用。同样，PDZ结构结合域基序的突变在影响NS1与PDZ结合蛋白的结合能力外也影响AKt的磷酸化［25］。NS1蛋白还可通过自身的核定位信号与宿主importinα/β结合，利用宿主的核质转运机制完成自身的运输过程，从而发挥其功能［26］。NS1蛋白也可与nucleolin蛋白相互作用，干扰nucleolin作用的发挥，从而抑制宿主细胞中某些抗病毒蛋白的合成，进而增强病毒的复制［27］。2008年8月，克鲁格教授和罗格斯大学吉他诺·蒙特莱恩教授领导的研究小组更是利用X射线晶体成像技术获得了NS1蛋白与人体CPSF30蛋白结合部位的三维结构图，使人们能够在原子水平以独特的视角观察NS1和人体蛋白的结合，了解NS1蛋白与人体CPSF30蛋白的作用模式以及抑制人体重要的抗病毒反应的重要机制。通过蛋白间的相互作用，NSl蛋白可增强病毒mRNA的转录与翻译、抑制宿主蛋白的合成、抑制干扰素的产生、下调细胞凋亡，从而促进病毒粒子的复制和释放、改变宿主蛋白的分布、降低宿主抗病毒能力。

3 展望

自21世纪以来，禽流感暴发越来越频繁，范围也越来越广，其蔓延速度及暴发规模达到了前所未有的程度，世界各地均受到了严重的影响。目前发现活禽市场可能是城市病例感染发病的危险因素，尚不能排除环境到人的传播途径。各种防控禽流感暴发的手段正在积极进行，但未发现短期内消除高致病性禽流感病毒的有效方法，所以加强对H5N1禽流感的了解，完善监控和预防禽流感的措施，是目前更好防控禽流感暴发的重要任务。目前国内外很多学者在致力于高致病性禽流感病毒H5N1的研究，NS1蛋白是一些A型流感病毒研究的热点。NS1蛋白在细胞中的作用已被发现但仍需进一步研究其功能，为揭示禽流感病毒致病的机制及抗禽流感药物靶位点的设计提供理论及实验依据。

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