Spry1和MAPK蛋白在病毒性心肌炎心肌组织中的表达

许弘飞，孟林，姚健，谷振勇，刘国庆，沈忆文，赵子琴

（1.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院法医学系，江苏苏州 215123；2.南通通大化学物安全性评价中心，江苏南通 226001；3.南通市公安局刑警支队，江苏南通 226001；4.南通大学医学院法医学系，江苏南通 226001；5.复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032）

Spry1和MAPK蛋白在病毒性心肌炎心肌组织中的表达

许弘飞1，2，孟林3，姚健3，谷振勇4，刘国庆4，沈忆文5，赵子琴5

（1.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院法医学系，江苏苏州 215123；2.南通通大化学物安全性评价中心，江苏南通 226001；3.南通市公安局刑警支队，江苏南通 226001；4.南通大学医学院法医学系，江苏南通 226001；5.复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032）

目的通过探讨Spry1和MAPK蛋白在病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）心肌组织中的表达，揭示其发病及猝死机制，并为法医学心源性猝死的鉴定提供指导。方法30只Balb/c雄性小鼠随机分为VMC组和对照组，分别腹腔注射柯萨奇B3病毒和Eagel’s培养液，处死小鼠取心脏，进行常规病理检查，并通过免疫组织化学、Western印迹法及real-time PCR方法检测心肌组织中Spry1蛋白及mRNA、MAPK蛋白表达变化。结果VMC组在光镜下可见心肌间质水肿，广泛炎症细胞浸润，心肌细胞坏死，心肌纤维形成多处灶性、大片状坏死，心肌组织中Spry1蛋白表达水平低于对照组（P＜0.05），Spry1 mRNA水平略降低（P＞0.05）；而MAPK蛋白表达水平在VMC组高于对照组（P＜0.05）。结论Spry1参与的MAPK/ERK通路在病毒性心肌炎心肌纤维化过程中起着促进胶原表达的作用，从而导致心律失常、心功能减退甚至心源性猝死。关键词：法医病理学；猝死，心脏；病毒性心肌炎；Spry蛋白；MAPK蛋白

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是目前严重威胁人类生命健康的最常见的心血管疾病之一，其猝死率列心源性猝死的第三位，仅次于冠心病和高血压病[1]。在青壮年中，由心肌炎所致的猝死率高达17%～21%，儿童患VMC预后较差，病死率更可高达50%[2]，近年来VMC发病率有升高的趋势，已引起国内外学者的普遍关注。虽然国内外很多学者从病因、病理变化、发病机制、流行病学调查、临床治疗及动物实验等方面对其进行过较多研究，但该病的发病机制复杂，病理组织形态改变无特异性，前期症状不明显，猝死率较高。本研究旨在通过探讨Spry1、MAPK蛋白在VMC心肌中的表达情况，揭示VMC发病及猝死机制，并为法医学心源性猝死的鉴定提供指导。

1 材料与方法

1.1 动物

30只纯种Balb/c小鼠（4周龄，雄性，SPF级，体质量12～16 g），由复旦大学动物实验科学部提供，并饲养于复旦大学动物实验科学部SPF级环境中。

1.2 病毒

柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）Nancy株，由复旦大学附属中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室提供，在Hela细胞中传代，冻融、离心3次，上清液分装，在Hela细胞测50%组织感染率（50% tissue culture infective dose，TCID50）为107，-70℃保存备用，实验用病毒量为1×105TCID50。

1.3 主要试剂

Spry1抗体（兔抗，美国Abcam公司），MAPK抗体（兔抗，美国Millipore公司），PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa公司）。

1.4 动物模型制作

随机选取10只小鼠，腹腔注射不含病毒的Eagel’s培养液（EMEM）作为对照组；其余20只小鼠按文献[3]方法腹腔内无菌注射0.1mL CVB3（1×105TCID50）制作急性病毒性心肌炎动物模型作为VMC组。

定义 11 设(U,A∪D)是一个覆盖决策系统,U/D={k=1,2,…,l}, B⊆A。如果RSθ,η(B,D)⟹RSθ,η(A,D),B称为(U,A∪D)的规则蕴含关系保持的一致集;否则称其为(U,A∪D)的规则蕴含关系保持的不一致集。如果RSθ,η(B,D)⟹RSθ,η(A,D)且对∀B有RSθ,η(B{a},D)⟹/ RSθ,η(A,D),那么B称为(U,A∪D)的一个规则蕴含关系保持的约简。所有的约简记为所有约简的交集称为(U,A∪D)的核,并记为

1.5 实验方法

1.5.1 组织取材及切片制备

将上述动物于7d后腹腔注射戊巴比妥（40mg/kg）后处死并取出心脏。心脏瓣膜下取小块左、右心室组织做组织学分析，固定在4%pH为7.2的多聚甲醛缓冲液中固定并包埋，切片后进行HE染色。剩余的左、右心室组织在液氮中冰冻保存。

1.5.2 Western印迹法分析

组织先用匀浆器碾碎后，用RIPA裂解液提取组织蛋白质，用BCA蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）测浓度。取100g组织，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，用第二抗体偶联物进行免疫检测，发光底物显迹法进行显迹，经显影、定影后分析杂交信号，并以同一张膜上重复杂交，GAPDH作为对照，用1D凝胶分析软件Quantity one（美国Bio-Rad公司）分析结果。

1.5.3 Real-time PCR检测

采用TRIzol试剂（美国Invitrogen生命技术公司）抽提心肌组织总RNA，获得的RNA按反转录试剂盒说明书进行合成cDNA。按PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）说明书进行RNA扩增，Spry1（NM_011896）引物序列正向：5′-ACCCTTCCTGTGTTTTCAT-3′和反向：5′-AGTCACCTTGCTTTTCTTG-3′；内参照基因GAPDH引物序列正向：5′-CTGACATGCCGCCTGGA GA-3′和反向：5′-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3′。PCR反应采用二步法，具体条件：95℃预变性30 s；95℃5s，60℃34s，40个循环；最后4℃保存。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 心肌组织HE染色

VMC组在光镜下可见小鼠心肌间质水肿，广泛炎症细胞浸润，心肌细胞坏死，心肌纤维崩解、断裂，形成多处灶性、大片状坏死（图1）。

图1 VMC组与对照组心肌组织HE染色

2.2 心肌组织Spry1蛋白Western印迹法结果及mRNA改变

通过Western印迹法对Spry1蛋白进行检测，发现VMC组小鼠腹腔注射病毒后7 d，Spry1蛋白阳性表达较GAPDH明显降低，而在对照组中，Spry1蛋白的表达水平没有发生改变（图2）。Real-time PCR检测结果显示，VMC组Spry1蛋白水平较对照组降低（P<0.05），而mRNA水平无明显变化（P＞0.05，表1）。

图2 Spry1蛋白电泳结果

表1 两组Spry1、MAPK蛋白表达量（±s）

表1 两组Spry1、MAPK蛋白表达量（±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05

组别例数Spry1蛋白Spry1 mRNAMAPK蛋白对照1011.964±1.8721.211±0.3398.083±1.274 VMC203.181±1.1051）1.016±0.499 25.012±1.8101）

2.3 心肌组织MAPK蛋白Western印迹法结果

以电泳条带上GAPDH（相对分子质量36 000）为标志，各组Western印迹法电泳均可显示在相对分子质量38000范围的条带，VMC组MAPK显色较GAPDH增强（图3）。VMC组左室心肌组织MAPK蛋白相对含量较对照组增多（P＜0.05，表1）。

图3 MAPK蛋白电泳结果图

3 讨论

心肌纤维化是心肌间质中胶原过度沉积的结果，心肌胶原含量显著升高或胶原容积积分显著高于正常值，是病毒性心肌炎慢性期的主要病理变化。近年来认识到病毒性心肌炎心肌纤维化可以影响病程和预后，是心脏疾病出现心律失常、心功能减退甚至心源性猝死的重要原因[4]。

细胞外基质是心肌间质的主要成分，主动参与心肌重构，细胞外基质主要由成纤维细胞分泌的胶原蛋白构成，其中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维是正常及病理心肌间质网络的主要成分[5]。病理性心肌重塑时，实质与间质不成比例增生（后者增多）是引起心功能由代偿转向失代偿及心衰的重要原因之一。Li等[6]采用Balb/c小鼠腹腔接种CVB3建立病毒性心肌炎模型，10d后心肌活检发现CD3 T细胞大量浸润，肿瘤坏死因子α，白细胞介素1、4（IL-1、IL-4），转化生长因子（transforming growth factor，TGF）表达增加，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及Ⅰ/Ⅲ型胶原比值均明显升高。

Spry基因家族成员作为纤维组织母细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）诱发的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）信号转导通路中的抑制因子，可能具有抑制血管重建和肿瘤发生作用。研究[7-8]显示，Spry1主要通过调节Ras-Raf-MEKMAPK传导通路信号输出的强度和时间，控制细胞周期，抑制细胞增殖，影响细胞的凋亡和存活。迄今为止，已有4种哺乳动物的Spry基因被发现，结构上，Spry蛋白的富含半胱氨酸的C末端具有很强的保守性，是其定位于活化细胞胞膜上的靶区域[9-11]，而N末端存在较强的变异性。根据其序列差异，Spry蛋白分为4种亚型（Spry1、Spry2、Spry3、Spry4），Spry1对MAPK信号途径的抑制作用显著高于其他亚型。由于其显著的生物学效应，Spry1成为当前的研究热点。

研究[12]表明，MAPK信号通路负责将细胞外刺激信号转至细胞核内，参与细胞增殖、分化、转化及凋亡等细胞生物学行为。细胞内MAPK的活化受到多种因素严密调控，Spry1是FGF及EGF等受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路的负调控因子[13]，通过负反馈机制抑制MAPK/ERK信号通路，从而遏制生长因子介导的细胞增殖、迁移及分化。Spry1基因在前列腺癌、乳癌及恶性胶质瘤中受抑制或沉默，因此被视为抑制MAPK-ERK通路的抑癌基因[14-15]。

本研究发现，通过Western印迹法检测VMC组心肌组织Spry1蛋白电泳结果较对照组显色减弱，MAPK蛋白相对含量较对照组显色增强；real-time PCR检测结果显示，VMC组Spry1的mRNA水平与对照组无明显变化（P＞0.05），而MAPK蛋白相对含量较对照组增多（P＜0.05）。

Hoshijima等[16]认为，在心衰的进展中，存在双阶段的信号激活级联，一是在压力负荷或牵张的初期，与细胞生存或增生有关；二是在增生信号激活的同时也启动负反馈信号通路。在压力负荷下，初期MAPK激活引起心肌肥大，以增加心功能，代偿压力负荷；而MAPK活性降低可能显示心肌细胞增生、肥大能力减弱，心功能失代偿导致心衰。本研究结果与此一致，Spry1参与的MAPK/ERK通路在病毒性心肌炎心肌纤维化过程中起着促进胶原表达的作用，从而导致心律失常的发生、心功能减退甚至心源性猝死。

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Myocardial Expression of Spry1 and MAPK Proteins of Viral Myocarditis

XU Hong-fei1,2,MENG Lin3,YAO Jian3,GU Zhen-yong4,LIU Guo-qing4,SHEN Yi-wen5,ZHAO Zi-qin5
（1．Department of Forensic Medicine,School of Biology and Basic Medical Sciences,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Nantong Tongda Chemicals Safety Evaluation Center,Nantong 226001,China;3.Criminal Police Branch,Nantong Public Security Bureau,Nantong 226001,China; 4.Department of Forensic Medicine,Medical College of Nantong University,Nantong 226001,China;5.Department of Forensic Medicine,Shanghai Medical College of Fudan University,Shanghai 200032,China）

ObjectiveTo discuss the myocardial expression of Spry1 and MAPK proteins of viral myocarditis（VMC）,to reveal its mechanism of sudden death,and to provide guides for forensic identification of sudden cardiac death.MethodsThirty Balb/c male mice were randomly divided into VMC group and control group,inoculated intraperitoneally with Coxsackievirus B3 and Eagel’s solution,respectively．After the mice were sacrificed,the cardiac tissues of the mice were taken to proceed regular pathological examination.The changes of Spry1 protein,Spry1 mRNA and MAPK protein were detected by immunohistochemistry,Western blotting and real-time PCR.ResultsUnder light microscope,the pathologic changes included myocardial interstitial edema,inflammatory cells infiltration,myocardial necrosis, and focal and patchy necrosis of myocardial fiber in VMC group.The expression of Spry1 protein in VMC group was lower than that in control group（P＜0.05）.There was slightly decreased expression of Spry1 of the mRNA level in VMC group（P＞0.05）.But the MAPK protein expression in VMC group was higher than that in control group（P＜0.05）.ConclusionThe pathway of MAPK/ERK involving Spry1 protein accelerates the expression of collagen,which may contribute to arrhythmia,heart failure and even sudden cardiac death.

forensic pathology;death,sudden,cardiac;vital myocarditis;Spry protein;MAPK protein

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.002

1004-5619（2013）03-0164-04

2012-07-17）

（本文编辑：刘宁国）

国家自然科学基金资助项目（81172897）；南通市自然科学基金资助项目（BK2011053）

许弘飞（1980—），男，安徽芜湖人，博士，讲师，主要从事心源性猝死的法医病理学研究；E-mail：whhongfei@sina.com

赵子琴，女，教授，博士研究生导师，主要从事法医病理学研究；E-mail：zqzhao@shmu.edu.cn