病毒性心肌炎致死者心肌中VCAM-1和caspase-3的表达

高迪，唐新华，黄京璐，郝博，汤大为，李明，罗斌

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080；2.东源县公安局，广东东源 517500）

·论著·

病毒性心肌炎致死者心肌中VCAM-1和caspase-3的表达

高迪1，唐新华2，黄京璐1，郝博1，汤大为1，李明1，罗斌1

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080；2.东源县公安局，广东东源 517500）

目的观察病毒性心肌炎致死者心肌组织中血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表达及分布特点，探讨病毒性心肌炎的发病、致死机制。方法收集病毒性心肌炎致死案例20例作为实验组，交通事故致创伤性、失血性休克死亡案例10例作为对照组，取心肌组织切片进行VCAM-1及caspase-3免疫组织化学染色后显微镜下观察，经图像分析和统计学处理，比较两组染色后VCAM-1及caspase-3阳性表达的差异。结果（1）实验组VCAM-1免疫组织化学染色阳性表达呈深棕黄色，染色部位主要位于血管内皮细胞内，对照组呈微弱阳性表达。实验组平均光密度高于对照组（P＜0.05）。（2）实验组caspase-3免疫组织化学染色阳性表达为棕红色颗粒，主要位于心肌血管周围炎症细胞中，实验组阳性细胞数多于对照组（P＜0.05）。结论VCAM-1可能在病毒性心肌炎引起的炎症细胞渗出过程中发挥重要作用，可为病毒性心肌炎致死案例中的法医病理学诊断提供参考，而caspase-3介导的心肌细胞凋亡参与病毒性心肌炎晚期致死机制的作用不明显。

法医病理学；血管细胞黏附分子-1；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；细胞凋亡；病毒性心肌炎

病毒性心肌炎主要是由柯萨奇病毒（A、B族）、埃可病毒（ECHO）、脊髓灰质炎病毒等引起的心肌局限性或弥漫性的感染，严重地威胁着人类健康，尤其是男性青壮年。病毒性心肌炎的病理改变主要以心肌细胞变性、坏死及间质炎症细胞浸润和纤维化为主，然而其发病机制尚未完全阐明[1]。本研究通过观察病毒性心肌炎致死者心肌血管内皮细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表达、血管周围炎症细胞的渗出及心肌组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表达，探讨病毒性心肌炎的早期发病机制及致死机制，旨在为病毒性心肌炎的法医病理诊断及相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

收集2006—2011年中山大学法医鉴定中心尸检后诊断为病毒性心肌炎致死的案例20例，作为实验组；因车祸致创伤性休克或失血性休克死亡且心脏无基础病变的案例10例，作为对照组。

实验组中男性11例，女性9例，年龄为7～53岁。根据案情资料，实验组多以发热、感冒、胸痛等为主要首发症状，部分病例还伴有头痛、腹痛、心悸、呕吐、腹泻等症状；尸检时尸斑明显、双手指甲床发绀，体表除医源性损伤外未见明显机械性损伤，脑、肝、脾、肺、肾等重要器官淤血，余未见明显异常。对照组男性8例，女性2例，年龄为20～57岁，未见上述症状表现。

1.2 试剂

兔VCAM-1多克隆抗体（0.2 mL，武汉博士德生物工程有限公司），兔caspase-3单克隆抗体（100μg，美国赛信通公司），生物素化的羊抗兔IgG抗体、即用型SABC免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 HE染色及免疫组织化学染色

低温保存尸体1～3d后提取心肌组织，并置于10%甲醛溶液中固定72h后制成蜡块保存。按常规制作切片后，分别进行HE染色和免疫组织化学染色。

免疫组织化学染色按照SABC试剂盒说明书进行。PBS缓冲液取代一抗作为空白对照。

1.4 结果判定及统计学处理

随机选取每张切片中5个阳性表达血管视野（×200），使用Image-Pro Plus 6.0软件测定血管内皮细胞内VCAM-1抗体阳性反应物的平均光密度值及血管周围caspase-3抗体阳性细胞数，数据用±s表示。采用SPSS 16.0统计软件，以t检验进行分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色结果

实验组心外膜下、肌层、心内膜见大量淋巴细胞弥漫性浸润，部分心肌组织呈灶样坏死，间质血管扩张、充血，可见广泛性淋巴细胞及单核细胞浸润，部分心脏传导组织中窦房结、房室结及希氏束区也可见大量淋巴细胞浸润。对照组未见该形态。

2.2 免疫组织化学染色结果

2.2.1 VCAM-1染色

实验组心肌间质血管内皮细胞呈VCAM-1强阳性表达，阳性反应物位于血管内皮细胞内，呈深棕黄色（图1A），对照组心肌间质血管内皮细胞呈VCAM-1微弱阳性表达（图1B）。两组平均光密度值比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

图1 VCAM-1免疫组织化学染色结果SABC×200

表1 VCAM-1免疫组织化学平均光密度（±s）

表1 VCAM-1免疫组织化学平均光密度（±s）

组别例数平均光密度实验200.2626±0.0190对照100.1768±0.0064

2.2.2 caspase-3染色

实验组VCAM-1抗体免疫组织化学表达强阳性的心肌组织中心肌细胞几乎无阳性表达，但血管周围可见大量炎症细胞caspase-3表达阳性（图2A），对照组VCAM-1抗体免疫组织化学表达微弱阳性的心肌组织中几乎无caspase-3阳性表达（图2B）。两组阳性细胞数比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

图2 caspase-3免疫组织化学染色结果SABC×200

表2 caspase-3免疫组织化学阳性细胞数（±s）

表2 caspase-3免疫组织化学阳性细胞数（±s）

组别例数阳性细胞数实验20139.5417±50.1179对照101.2183±0.3927

3 讨论

近年来，由病毒性心肌炎导致的青壮年心源性猝死较为常见[2-3]。目前研究[1，4-5]发现，病毒复制、炎性介质、细胞凋亡、内皮细胞功能障碍、免疫调控失衡、心肌纤维化等多种因素参与病毒性心肌炎的发病及致死机制。病理性细胞凋亡在病毒性心肌炎发病中的作用近年来受到重视，细胞介导的免疫反应可导致细胞凋亡和坏死。

细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAM）是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互接触和结合的膜表面糖蛋白的统称，以受体-配体结合的形式发挥作用。VCAM-1则是一类糖蛋白分子，是细胞黏附分子免疫球蛋白家族的重要成员之一，广泛分布于细胞因子活化的内皮细胞表面及上皮细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞表面。VCAM-1参与淋巴细胞的活化和迁移，在炎症、肿瘤转移、自身免疫性疾病等病理过程中也起重要作用[6]，在炎症反应中淋巴细胞等炎症细胞的聚集上有重要作用，参与单核-吞噬细胞和淋巴细胞的炎症部位浸润，其在血管内皮上的表达也被认为是炎症细胞从血管进入炎症区所必需的。正常情况下VCAM-1会有少量表达，但炎症病理条件下表达会显著增多。VCAM-1与其配体极迟反应抗原-4 （very late antigen-4，VLA-4）相结合才能发挥其生物学活性，VLA-4主要表达在淋巴细胞等单核细胞上。VCAM-1与细胞表面的VLA-4结合，使淋巴细胞黏附在内皮细胞表面，引起淋巴细胞活化，通过释放多种颗粒物质，破坏内皮细胞基底膜使膜脂质过氧化、细胞溶解，导致血管内皮渗透性增加，淋巴细胞便可以从血管大量渗出，到达炎症病灶。本实验结果表明，实验组心肌间质血管内皮VCAM-1表达较对照组显著增高，证明病毒性心肌炎血管周围炎症细胞聚集与VCAM-1升高有关。大量的炎症细胞（主要为淋巴细胞）聚集在心肌微血管内并浸润到心肌组织中，可释放细胞炎性物质、氧自由基和蛋白酶等物质，引起心肌损伤致死；同时炎症细胞浸润可启动机体免疫反应，并导致心功能障碍。为了证实心肌细胞凋亡所致的损伤和炎症细胞参与的免疫反应造成的损伤类型，本实验进一步对病毒性心肌炎组织进行caspase-3免疫组织化学染色。

细胞凋亡是一种基因控制的细胞自杀过程，在此过程中会产生许多凋亡执行因子，caspase家族蛋白是细胞凋亡过程中最主要的执行因子，其中caspase-3是导致细胞凋亡的最强大的效应因子，caspase-3的激活可以作为鉴定凋亡发生的标准之一[7-8]。caspase-3既参与凋亡启动，又参与凋亡程序执行，尤其在凋亡执行阶段，负责对全部或部分关键蛋白进行酶切（激活或灭活），与细胞凋亡关系密切。其机制可能为：caspase-3能诱导破坏细胞结构，导致细胞自稳功能严重失调和影响修复过程，最终使细胞解体[9]。Wang等[10-12]报道在柯萨奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）感染的实验小鼠心肌组织中caspase-3的表达与细胞凋亡相关，且caspase-3的表达与细胞凋亡强度呈正相关。本实验实验组及对照组心肌细胞几乎未见caspase-3的阳性表达，但在实验组心肌间质血管周围的炎症细胞见显著的caspase-3表达。由此可以推断心肌细胞凋亡机制在病毒性心肌炎的晚期致死机制中作用不明显，而病毒的直接复制及炎性介质参与的免疫作用溶解感染的心肌细胞可能为病毒性心肌炎的主要致死机制[13]。

本研究提示VCAM-1作为一项指标对诊断因病毒性心肌炎导致的心源性猝死具有法医学意义。病毒性心肌炎致死机制并非以心肌细胞的凋亡为主，而是由炎症介质参与的免疫机制造成的心肌损害为主，其具体免疫机制有待进一步研究。

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Expression of VCAM-1 and Caspase-3 in Myocardium of Persons Who Died from Viral Myocarditis

GAO Di1,TANG Xin-hua2,HUANG Jing-lu1,HAO Bo1,TANG Da-wei1,LI Ming1,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Dongyuan Public Security Bureau,Dongyuan 517500,China）

ObjectiveTo observe the expression and distribution of vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1）and caspase-3 in myocardium of persons who died from viral myocarditis and to explore its pathogenesis and death mechanism.MethodsTwenty cases died from viral myocarditis were selected as the experimental group.Ten cases died from traumatic shock and massive hemorrhage shock after traffic accidents were selected as the control group.The sections of myocardium were stained by immunohistochemistry for VCAM-1 and caspase-3,and observed under microscope.The positive expressions of VCAM-1 and caspase-3 of the two groups were compared with each other by image analysis and statistical analysis.Results（1）The vascular endothelial cells expressed VCAM-1 with dark nigger-brown colors in the experimental group,and weak expression was observed in the control group.The average optical density in the experimental group was higher than that in the control group（P＜0.05）.（2）The caspase-3 positive cells were mostly inflammatory cells around the myocardial vessels with brown-red granules in the experimental group.The positive cell number in the experimental group was higher than that in the control group（P＜0.05）.ConclusionVCAM-1 may play an important role in the inflammatory cells exudation caused by viral myocarditis,and may provide the reference for diagnosis of viral myocarditis in forensic pathology.However,the myocardial apoptosis mediated by caspase-3 doesn’t affect the lethal mechanism in the late stage of viral myocarditis.

forensic pathology;vascular cell adhesion molecule-1;caspase-3;apoptosis;vital myocarditis

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.001

1004-5619（2013）03-0161-03

2012-11-09）

（本文编辑：刘宁国）

国家自然科学基金资助项目（39700167）

高迪（1985—），男，山东龙口人，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：gaodi2008@qq.com

罗斌，男，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医病理学（猝死疾病）研究；E-mail：luobin@mail.sysu.edu.cn