缬沙坦对尾加压素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

任韫卓，史永红，韦金英，杜春阳，李宏博，段惠军

（河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北石家庄050017）

·论 著·

缬沙坦对尾加压素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

任韫卓，史永红，韦金英，杜春阳，李宏博，段惠军*

（河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北石家庄050017）

目的 观察缬沙坦对尾加压素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）对肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法将体外培养人肾小管上皮细胞（human kidney proximal tubular cell，HK-2）分为正常对照组、10-8mol/L UⅡ刺激组和10-8mol/L UⅡ+10μmol/L缬沙坦组。采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞凋亡百分比；Western-Blot检测Bax、Bcl-2的表达；荧光实时定量PCR（Real time-PCR）检测Bax、Bcl-2mRNA水平变化。结果①FCM法检测显示，与正常对照组相比，10-8mol/L UⅡ刺激组细胞凋亡百分比显著升高（P＜0.01）。10μmol/L缬沙坦能显著降低10-8mol/L UⅡ诱导细胞凋亡的百分比（P＜0.01）。②Western-Blot显示，10-8mol/L UⅡ刺激组，与正常对照组相比，Bcl-2表达显著降低（P＜0.05），Bax蛋白表达无明显变化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率明显升高（P＜0.01）。与UⅡ刺激组相比，缬沙坦使Bcl-2表达显著升高（P＜0.01），Bax蛋白表达无明显变化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率明显降低（P＜0.01）。③Real time-PCR显示，10-8mol/L UⅡ刺激组细胞Bcl-2mRNA表达显著减少（P＜0.01），BaxmRNA无明显变化（P＞0.05）。与UⅡ刺激组相比，缬沙坦显著升高Bcl-2mRNA水平（P＜0.01），BaxmRNA无明显变化（P＞0.05）。结论缬沙坦的肾脏保护作用可能部分是通过抑制UⅡ诱导的肾小管上皮细胞凋亡实现的。

肾小管，近端；上皮细胞；缬沙坦

尾加压素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是近年发现的体内最强的缩血管活性肽，在肾脏有着丰富的表达，尤其是肾小管和集合管上皮细胞［1］。研究显示，UⅡ在肾脏的高表达有可能有重要的意义［2］。UⅡ在肾脏病变中的作用正是研究的热点。肾小管上皮细胞在各种病因作用下凋亡增加是肾间质纤维化发生发展的关键和核心环节之一。缬沙坦（valsartan，Val）是近年来发现的一种血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂（angⅡtype 1 receptor antagonism，AT1RA），从受体水平上阻断AngⅡ的生物学作用。AT1RA在降低血压、减少尿蛋白、改善肾小球和小管间质损伤以及保护肾功能上具有肯定的效果。本研究着重探讨缬沙坦能否改善UⅡ诱导的人肾小管上皮细胞（human kidney proximal tubular cell，HK-2）的凋亡。

1 资料与方法

1.1 材料：人肾小管细胞HK-2（ATCC Manassas，VA，USA）。缬沙坦，北京诺华制药有限公司。UⅡ，美国Sigma公司。小鼠抗Bax单克隆抗体（P-19），兔抗Bcl-2多克隆抗体。Real time PCR试剂盒（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组刺激实验：常规培养细胞，待HK-2细胞达75%～85%汇合后，用无血清培养基同步24h。分成正常对照组、10-8mol/L UⅡ刺激组和10-8mol/L UⅡ+10μmol/L缬沙坦组。干预48h后收集细胞观察。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术（flow cytometric，FCM）检测细胞的凋亡百分比：①细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；②用PBS洗涤细胞2次，收集1～5×105细胞；③加入500μL Binding Buffer悬浮细胞；④加入5μL Annexin VEGFP混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；⑤室温、避光、反应5～15min；⑥1h内进行流式细胞仪的观察和检测。激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm。Annexin V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道（fluorescene 1，FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（fluorescene 3，FL3）检测。应用Muticycle AV（FACSAria，BD Biosciences，CA，USA）分析软件计算各期细胞百分率。

1.2.3 Western-Blot检测Bax和Bcl-2蛋白水平：

加入细胞裂解液，冰浴2h，4℃、12 000r/min离心20min，Lowry法测定上清液蛋白浓度。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移至聚偏二氟乙烯膜；质量分数0.05的脱脂奶粉封闭聚偏二氟乙烯膜2h，分别加入Bax、Bcl-2抗体，4℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔抗体（1∶4 000稀释），37℃孵育2h；洗膜后加ECL试剂，ODYSSEY远红外双色荧光成像系统显影（LI.COR Gene Company，USA）。用美国UVP公司LabWorks 4.5分析系统软件对Western条带进行定量分析。

1.2.4 荧光实时定量PCR检测Bax和Bcl-2表达变化：Trizol法提取细胞总RNA，进行反转录。荧光实时定量PCR采用20μL反应体系，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2X）10μL，ROX Reference Dye（50X）0.4μL，反转录产物2μL，上下游引物（终浓度为1μg/L）各0.8μL，ddH2O 6μL。反应条件为，95℃30s→95℃5s→55℃30s→72℃30s共40个循环。根据比较法计算基因表达相对量，采用公式2-ΔΔCt计算基因表达的相对倍数变化。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物列表Table 1 Primer sequences used for Real-tim e PCR analysis

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FCM检测细胞凋亡百分比：Annexin V+PI双染流式细胞计数散点图以Annexin V横轴，PI为纵轴，左上象限为损伤细胞，右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞，左下为阴性正常细胞，右下为早期凋亡细胞。正常对照组细胞凋亡率为（2.25±0.12）%，UⅡ刺激组细胞凋亡率为（46.92±0.36）%。与正常组相比，UⅡ刺激组细胞凋亡显著增加（P＜0.01）。

UⅡ+缬沙坦组细胞凋亡率为（27.21±0.04）%，较UⅡ刺激组明显减少（P＜0.01）。

2.2 Western-Blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达：与正常对照组相比，UⅡ刺激组Bcl-2蛋白表达显著降低（P＜0.01），Bax蛋白表达无明显变化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率显著增加（P＜0.01）。与UⅡ组相比，UⅡ+缬沙坦组Bcl-2蛋白水平明显升高（P＜0.01），Bax蛋白表达无明显变化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率降低（P＜0.05），见图1，2。

图1 3组HK-2细胞Bax和Bcl-2蛋白表达Figure 1 The expression levels of Bax and Bcl-2 in three groups

图2 3组HK-2细胞胞Bax/Bcl-2比率Figure 2 The ratio of Bax/Bcl-2 in three groups

2.3 Real-time PCR检测Bax和Bcl-2mRNA水平：与正常对照组相比，UⅡ刺激组Bcl-2 mRNA表达明显减少（P＜0.01），Bax mRNA水平无明显变化（P＞0.05）。与UⅡ刺激组相比，UⅡ+缬沙坦组Bcl-2mRNA显著升高，但BaxmRNA无明显变化。见表2。

表2 UⅡ刺激对HK-2 Bcl-2 and Bax mRNA表达的影响Table 2 Effect of UⅡinterference on Bcl-2 and Bax mRNA in HK-2 (±s，n=6）

表2 UⅡ刺激对HK-2 Bcl-2 and Bax mRNA表达的影响Table 2 Effect of UⅡinterference on Bcl-2 and Bax mRNA in HK-2 (±s，n=6）

*P＜0.01 vs NG #P＜0.01 vs UⅡG by q test

Groups Bcl-2 mRNA BaxmRNA NG 1.00±0.00 1.00±0.00 UⅡG 0.08±0.02*0.92±0.13 UⅡ+Val 0.56±0.11#0.89±0.19

3 讨 论

UⅡ最早是从鱼的脊髓尾部下垂体中分离出的生长抑素样环肽，是目前已知最强的缩血管活性肽。研究［3-5］表明，在许多心血管和代谢性疾病中UⅡ及其受体的水平均有上调，包括Ⅱ型糖尿病、肾功能失调、动脉粥样硬化和肥胖等，发挥着收缩血管、舒张血管及促丝裂等作用。近年来UⅡ在肾脏的病理生理作用受到关注［6］。在慢性肾脏病及肾移植患者中UⅡ水平明显升高［7-9］。凋亡是导致肾小管损伤的一种普遍机制。以往认为肾小管上皮细胞的增殖和肥大是肾间质纤维化、肾衰竭的主要原因。可是近几年的研究［10-11］表明，肾小管上皮细胞，尤其是近曲小管上皮细胞的凋亡在肾间质纤维化及肾功能的进一步丧失中起着重要作用。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统，尤其是血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），参与了肾脏疾病的病变发展，不仅在血流动力学调节而且在肾硬化和炎症性、纤维化中起重要作用［12］。缬沙坦是一种AngⅡ的多肽类似物，可以通过与AT1受体结合，阻断AngⅡ与AT1受体结合而发挥一系列作用。AT1RA除降压外，还具有明确的非血压依赖性肾脏保护作用。本研究重点观察缬沙坦能否改善UⅡ诱导的人HK-2的凋亡。首先选取了具有较高特异度和敏感度的Annexin V/PI双染流式细胞分析发现UⅡ刺激细胞后凋亡百分率较正常对照组显著升高，缬沙坦和UⅡ的共同孵育能够显著降低凋亡率。同时还检测了凋亡抑制基因Bcl-2及凋亡促进基因Bax的变化。它们与细胞凋亡或存活关系尤为密切，在受到刺激后由它们之间的不同比例来决定细胞的死亡或存活［13-14］。Bcl-2是细胞凋亡调控蛋白家族中最具特征的成员，通过调节细胞死亡启动因子和阻滞因子之间的平衡来抑制凋亡的发生。本研究结果显示，UⅡ刺激后Bcl-2蛋白和mRNA水平显著下降，Bax表达无明显变化，Bax/Bcl-2比率显著下降。应用缬沙坦干预后，HK-2的Bcl-2蛋白和mRNA水平较UⅡ刺激组显著上升，Bax表达无明显变化，Bax/Bcl-2比率下降也得到改善。推断缬沙坦的肾脏保护作用可能是部分通过抑制UⅡ诱导人肾小管上皮细胞的凋亡实现的。今后将对沙坦类药物的肾脏保护机制做更深入的研究。

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（本文编辑：刘斯静）

EFFECT OF VALSARTAN ON UROTENSINⅡINDUCED-APOPTOSIS IN HUMAN KIDNEY PROXIMAL TUBULAR EPITHELIAL CELL

REN Yunzhuo，SHIYonghong，WEIJinying，DU Chunyang，LIHongbo，DUAN Huijun*
(Department of Pathology，the School of Basic Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effect of valsartan on urotensinⅡ（UⅡ）inducedapoptosis in human kidney proximal tubular cell（HK-2）.MethodsHK-2 cellswere divided into three groups：normal group，10-8mol/L UⅡgroup，10-8mol/L UⅡ+10μmol/L Val group.Cellswere stained by annexin V/propidium iodide（PI）and apoptosis of HK-2 was analyzed by flow cytometry（FCM）.The expression levels of Bax and Bcl-2 were observed by Western-Blot.Real time-PCR was performed to assess the levels of Bax，Bcl-2mRNA.ResultsCompared with normal group（NG），the percentage of cell apoptosis significantly increased in HK-2 in UⅡstimulation group（P＜0.01）.FCM showed that valsartan made the cell apoptioic ratemuch lower than that of HK-2 of UⅡ-induced.The expressions of Bcl-2 protein and mRNA were decreased in UⅡ-stimulated HK-2 cell（s P＜0.05）.Valsartan could upregulate the expression of Bcl-2 protein and mRNA but it did not have any effect on the expression of Bax.The ratio of Bax/Bcl-2 was significantly increased in UⅡ-stimulated HK-2 cells（P＜0.01）. Valsartan could also greatly ameliorate the increase of ratio of Bax/Bcl-2（P＜0.01）.ConclusionValsartan has some renal protective effects on renal interstitial fibrosis，partly through inhibiting UⅡinduced-apoptosis in human kidney proximal tubular cell.

kidney tubules，proximal；epithelial cells；valsartan

R332

A

1007-3205（2013）09-0993-04

2013-08-01；

2013-08-11

国家自然科学基金（30100244）；河北省教育厅科学研究计划项目（2007130）；河北省自然科学基金（30100098）

任韫卓（1978-），女，河北石家庄人，河北医科大学基础医学院副教授，医学博士，从事肾脏病理学研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.09.001