毛细管区带电泳法拆分维拉帕米对映体

王 乐，程晓昆，王娅莉，薛 娜，陈 晶，郭 丽

（1.河北化工医药职业技术学院制药工程系药物制剂教研室，河北石家庄050026；2.华北制药集团新药研究开发有限责任公司仪器分析研究室，河北石家庄050015；；3.河北医科大学第四医院药品科，河北石家庄050011）

·论 著·

毛细管区带电泳法拆分维拉帕米对映体

王 乐1，程晓昆2，王娅莉2，薛 娜1，陈 晶1，郭 丽3*

（1.河北化工医药职业技术学院制药工程系药物制剂教研室，河北石家庄050026；2.华北制药集团新药研究开发有限责任公司仪器分析研究室，河北石家庄050015；；3.河北医科大学第四医院药品科，河北石家庄050011）

目的以羟丙基环糊精为手性添加剂建立维拉帕米对映体的毛细管区带电泳拆分方法。方法分别考察分离电压、添加剂种类及浓度、缓冲溶液pH值等参数对实验结果的影响，从而确定维拉帕米的最佳拆分条件。结果维拉帕米对映体得到了较好的分离，分离度可达5.52。结论该方法可用于维拉帕米对映体的分离，具有快速、准确性好、成本低等优点。

维拉帕米；电泳，毛细管；环糊精类

维拉帕米（verapamil），又名异搏定（Isoptin），由罂粟碱衍生而得，是一种手性药物，作为钙通道阻滞剂被广泛应用于高血压、心绞痛、心律失常、脑血管等疾病的治疗［1－4］。有研究［5］表明，其钙通道拮抗作用主要归因于（S）-异构体，而（R）-异构体的钙通道拮抗作用仅为（S）-异构体的1/10。为了使产品达到更好的疗效并保障用药安全性，对维拉帕米对映体进行手性拆分研究具有重要意义。毛细管电泳因为快速、高效、微量等优势已被广泛应用于手性分离分析中［6－9］，β-环糊精及其衍生物作为手性选择剂已被毛细管电泳等分离分析方法广泛采用［10］。本文以羟丙基倍他环糊精（hydroxypropyl-βcyclodextrin，HP-β-CD）作为手性选择剂，建立了维拉帕米对映体的毛细管区带电泳拆分方法，达到了较好的分离效果，且快速便捷、准确性好、成本低，可用于维拉帕米对映体的手性分离。

1 材料与方法

1．1 仪器：高效毛细管电泳仪（北京彩陆科学仪器有限公司，中科院研究生院应用化学所），内设可变波长的紫外检测器；HW-2000色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；BS210S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHs-3C型酸度计（上海精科仪器有限公司）。

*通讯作者

1．2 试药：S-维拉帕米（S-verapamil，S-VP）和R-维拉帕米（R-verapamil，R-VP）均购自上海禾丰制药有限公司（分析纯）；磷酸与磷酸二氢钠均购于天津市美琳工贸有限公司（分析纯）；HP-β-CD（山东新大精细化工有限公司，分析纯）；去甲万古霉素（华北制药华胜有限公司，分析纯）；氢氧化钠（天津市华东试剂厂，分析纯）；其他所用试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水。

1．3 方法

1．3．1 溶液配制：称取S-VP、R-VP各5 mg，分别用超纯水定容至5g/L。实验时，各取上述储备液0.1mL，用超纯水定容至1mL，配制成0.5g/L维拉帕米对映体的混合溶液。

1．3．2 电泳条件：未涂层熔硅石英毛细管柱（内径50μm，柱长53cm，有效长度45cm，邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司）；运行缓冲溶液含100mmol/L磷酸二氢钠、20mmol/L HP-β-CD，用磷酸调节pH值至6.0；检测波长254nm，分离温度20℃，分离电压10kV；样品采用重力进样，进样高度17cm，进样时间3s。

每次进样之前，毛细管柱用0.1mol/L NaOH溶液冲洗5min，超纯水冲洗10min，缓冲溶液平衡10min；缓冲溶液和试液均经过0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气后使用；每个样品重复进样3次。

2 结 果

分别将S-VP对照品溶液、R-VP对照品溶液和按照2.1方法配制的维拉帕米对映体混合溶液注入高效毛细管电泳仪（见图1～3）。在1.3.2所示电泳条件下，维拉帕米对映体得到了较好分离，分离度达5.52。

图1 S-VP对照品溶液电泳图Figure 1 Electrophoregram of S-VP

图2 R-VP对照品溶液电泳图Figure 2 Electrophoregram of R-VP

图3 维拉帕米对映体分离电泳图Figure 3 Electrophoregram of verapamil enantiomers

2．1 运行电压的选择：在5～15kV范围内考察了分离电压对分离度的影响（图4）。实验结果表明，电压较低时，分析所用时间较长，谱峰拖尾严重，分离度较小；而电场强度过大时，所产生的大量焦耳热会导致不均匀的温度梯度和局部的黏度变化而引起区带展宽，使得分离效率下降。最终选择10kV作为分离电压。

图4 运行电压对维拉帕米对映体分离度的影响Figure 4 Influence of voltage on the resolution of verapamil enantiomers

2．2 手性添加剂的选择：正确构建手性环境是分离手性分子的关键。本文分别考察了HP-β-CD和去甲万古霉素作为手性添加剂对维拉帕米对映体分离的影响（图5）。实验结果表明，HP-β-CD作为手性添加剂其浓度达到10mmol/L，对映体就有明显的分离效果；而去甲万古霉素在1.0～5.0mmol/L浓度范围内对映体均无分离效果。由于去甲万古霉素有紫外吸收，浓度继续增加会导致仪器噪音严重增加，基线不稳定，因此本实验选择HP-β-CD为手性

添加剂。

图5 不同手性选择剂拆分维拉帕米对映体的色谱图A.4mmll/L去甲万古霉素；B.10mmol/L羟丙基倍他环糊精Figure 5 Chromatograms of verapamil enantiomers separated by norvancomycin and HP-β-CDA.4mmol/L norvancomycin；B.10mmol/L HP-β-CD

2．3 HP-β-CD浓度的选择：分别配制10、15、20、25、30、40mmol/L的HP-β-CD缓冲溶液，考察HP-β-CD浓度对维拉帕米对映体分离效果的影响（图6）。实验结果显示，在0～25mmol/L范围内分离度随HP-β-CD浓度的增加而逐渐增大；而超过25mmol/L后HP-β-CD浓度继续增加，分离度则有下降的趋势。S-VP和R-VP的理论塔板数分别在15mmol/L和20mmol/L之后出现明显下降的趋势。综合分离度和理论塔板数两方面因素考虑，本文选择HP-β-CD的浓度为20 mmol/L。

图6 HP-β-CD浓度对理论塔板数及分离度的影响▼R-VP理论塔板数；●S-VP理论塔板数；■分离度Figure 6 Influence of concentration of HP-β-CD on the resolution of Verapamil enantiomers▼plate number of R-VP；●plate number of S-VP；■resolution

2．4 缓冲液pH值的选择：在电泳中缓冲液的pH值是影响分离效果的重要因素之一，通过调整pH值可以优化分离度。本实验考察了缓冲溶液pH值在4～6.5范围内对维拉帕米对映体的分离效果的影响，结果表明缓冲液pH在4～6范围内，分离度随pH增加而增大；而pH＞6之后分离度逐渐下降，因此确定电泳中缓冲液的pH值为6。

2．5 精密度的考察：以S-VP为例，其日间（n＝6）和日内（n＝6）测定的峰面积的标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为3.1％和2.7％，柱效的RSD分别为2.8％和3.3％。结果表明，该方法的精密度较高，重现性较好。

3 讨 论

本文建立了以HP-β-CD做手性添加剂采用毛细管区带电泳拆分维拉帕米对映体的方法。实验结果表明，该对映体在6min之内即达到了良好的分离效果。本方法体系简单、易操作、分析速度快、结果准确、分析成本低，且不污染环境，为维拉帕米对映体的分离检测提供了良好的依据。

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［3］张福志，傅红兴，陈密特，等.盐酸维拉帕米不溶性微孔膜缓释胶囊的制备和体外释药试验［J］.中国现代应用药学杂志，2011，28（6）：537－541.

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［5］范瑞芳，史雪岩，顾峻岭，等.维拉帕米和布比卡因的毛细管电泳手性拆分［J］.分析化学研究简报，2003，31（6）：706－708.

［6］赵艳敏，赵艳芳.手性配体交换毛细管电泳研究进展［J］.化学试剂，2010，32（5）：422－426.

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［10］李英杰，陈治春，高立娣，等.羧甲基聚合-β-环糊精作为选择剂应用于毛细管电泳法拆分手性化合物［J］.化学工程师，2009，45（5）：586－588.

（本文编辑：刘斯静）

CHIRAL SEPARATION OF VERAPAM IL ENANTIOMERS BY CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS

WANG Le1，CHENG Xiaokun2，WANG Yali2，XUE Na1，CHEN Jing1，GUO Li3*
（1．Department of Pharmaceutical Engineering，Hebei Chemical＆Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，China；2．New Drug R＆D Center，North China Pharmaceutical Corporation，Shijiazhuang 050015，China 3．Department of Pharmacy，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China）

Objective To establish a method of capillary zone electrophoresis for the chiral separation of verapamil enantiomers using hydroxypropyl-β-cyclodextrin as the chiral selector.MethodsStudieswere performed with several parameters，i.e.the running voltage，pH of the running buffer，type and concentration of the additives.ResultsVerapamil enantiomers were separated well with the resolution of 5.52.ConclusionThe Results indicate that thismethod is accurate and suitable for the chiral separation of verapamil enantiomers.

verapamil；electrophoresis，capillary；cyclodextrins

R917

A

1007-3205（2013）05-0556-03

2012－12－04；

2013－01－17

王乐（1978－），男，河北保定人，河北化工医药职业技术学院讲师，医学硕士，从事药物制剂及质量控制研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.021