黄芪对自体脂肪颗粒移植存活率的影响

武承兴 王 健 张波 郑 丹 宁余力

黄芪对自体脂肪颗粒移植存活率的影响

武承兴 王 健 张波 郑 丹 宁余力

目的探讨黄芪对自体脂肪颗粒移植成活率的影响。方法建立新西兰大白兔自体脂肪移植动物模型，设立实验组和对照组，实验组予以肌肉注射不同剂量的黄芪注射液。检测血液中VEGF含量，脂肪移植体剩余重量，计算移植脂肪的存活率；HE染色后镜下观察脂肪移植组织细胞形态和血管密度；血管内皮细胞Ⅷ因子免疫组化法观察新生血管生长情况及密度。结果实验组移植脂肪组织存活率明显高于对照组；实验组血清VEGF表达水平明显高于对照组；HE染色及血管内皮细胞Ⅷ因子免疫组织化学染色显示实验组在脂肪细胞数量、形态、脂肪移植体纤维化程度及新生毛细血管密度等方面均优于对照组。结论黄芪注射液能够显著提高新西兰大白兔自体脂肪颗粒移植的存活率。

黄芪自体脂肪移植血管内皮细胞生长因子存活率

软组织缺损造成的临床先天或后天性畸形的发病率逐年上升，整复外科应用各种方法，通过组织的移植、充填修复软组织缺损[1-5]。自体脂肪组织作为理想的软组织充填材料，来源丰富、易于获取、供区损伤小，但长期存活率却无法预测[6]。近年来，很多研究都关注于提高自体游离脂肪的移植存活率[6-12]。研究表明，血运重建对于颗粒脂肪移植存活率有重要意义，提高脂肪移植存活率的关键是改善血液循环，尽快重建游离脂肪的血运[11-12]。

黄芪是最常用的益气中药，黄芪对促进缺血区血管新生的相关研究认为，黄芪可明显上调VEGF水平，促进血管内皮细胞增殖及DNA合成[13-15]。于是我们设想，是否可以使用黄芪注射液促进移植脂肪组织新生血管的形成，提高脂肪颗粒移植物的存活率？本实验建立新西兰大白兔自体脂肪移植动物模型，观察黄芪注射液对脂肪移植体血运重建、新生毛细血管变化、脂肪颗粒移植物成活率的影响，为临床提高脂肪移植成活率提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、材料

黄芪注射液（正大青春宝药业有限公司）；VEGF的ELISA试剂盒（R&D公司）；兔多克隆血管内皮细胞Ⅷ因子抗体（Biorbyt公司）；鼠兔通用免疫组化二抗（Dako公司）；免疫组化抗体稀释液（Dako公司）；磷酸盐缓冲液、盐酸氯胺酮注射液、陆眠宁Ⅱ注射液（上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心提供）

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及其分组情况

健康新西兰大白兔15只（上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心提供），雌雄不限，体质量约2.5～3.0 Kg，随机分成3组：对照组5只（单纯自体脂肪移植）；实验1组5只（自体脂肪移植+肌肉注射黄芪注射液2.5 g/Kg.d）；实验2组5只（自体脂肪移植+肌肉注射黄芪注射液5 g/Kg.d），均持续用药2周。

1.2.2 自体脂肪颗粒移植动物模型的建立

动物术前禁食12 h，盐酸氯胺酮注射液0.10 mL/Kg及陆眠宁Ⅱ注射液0.20 mL/Kg肌肉注射麻醉。刮除单侧腹股沟及双耳背部皮毛，固定，消毒，铺巾，于腹股沟上1.5 cm处斜行切口，长约3 cm，切开皮肤全层暴露腹股沟脂肪垫（图1），取出脂肪总量约2.5 mL，立即转移到PBS溶液中，彻底冲洗，剪碎，获得直径1～2 mm的脂肪颗粒。消毒耳背部皮肤，将脂肪颗粒吸入2 mL注射器内，以8号注射针头分别注入双耳背部皮下共4个部位，每次0.5 mL（图2）。

图1 暴露腹股沟脂肪组织并游离Fig.1The fat tissue in the groin area was exposed and dissociated

图2 移植脂肪组织注射入兔耳背部皮下Fig.2The autologous fat particle were injected into thesubcutaneous area of the rabbit

1.2.3 标本采集

分别于术后1周、2周、4周、6周、8周耳缘静脉取血，每只取血1 mL，离心后取上层血清，-80℃冰箱保存，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清VEGF表达水平。术后3月进行脂肪移植体标本取材，于脂肪移植体外周1 cm处切开皮肤，沿被膜仔细分离，完整取下脂肪移植体，分离，修去周围组织及包膜，准确秤重，与术前记录对比得到移植存活率。然后4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，行HE染色及血管内皮细胞Ⅷ因子免疫组化染色。

1.2.4 统计学分析

使用SPSS13.0软件进行处理，所有数据以均数±标准差表示，采用t检验或单因素方差分析进行检验，存活率比较采用卡方检验，双侧检验水准为α=0.05，P＜0.05认为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 自体脂肪移植组织大体观察

自体脂肪移植术后90 d取材，大体观察可见实验组脂肪组织移植体体积均大于对照组，其中实验组2体积最大（图3）。

图3 自体脂肪移植术后90天各组脂肪组织移植体体积对比Fig.3The volume comparison of fat grafts in each group 90 days after autologous fat transplantation

2.2 各组脂肪移植体存活率比较

术后90 d，对照组脂肪移植存活率（43.6±5.5）%，实验组1脂肪移植存活率（61.9±7.2）%，实验组2脂肪移植存活率（63.5±7.3）%。实验组脂肪组织移植存活率均明显高于对照组，具有统计学意义（P＜0.05）；实验组1与实验组2脂肪组织移植存活率无统计学差异（P＞0.05）（图4）。

图4 各组间脂肪移植体存活率比较Fig.4The survival rates of fat grafts among each group

2.3自体脂肪颗粒移植各组间血清VEGF表达

实验组1与实验组2的血清VEGF表达水平在移植术后1周、2周、4周和6周时，均比对照组明显增高（P＜0.05），在术后2周时达到高峰。实验组1与实验组2血清VEGF表达水平无显著差异（P＞0.05）（图5）。

图5 各组血清VEGF表达Fig.5The VEGF concentration of blood serum among each group

2.4 组织学观察

HE染色显示，对照组移植脂肪组织中有较多脂肪细胞坏死融合，形成了大小不等的空泡，存活脂肪细胞大小不规则，分布不均匀，呈岛状散布在脂肪移植体中，偶见慢性炎性反应，纤维结缔组织较多，并有分隔倾向，血运不丰富，新生血管不明显。实验组1和实验组2均可见脂肪细胞增生，组织纤维间隔不多，脂肪小叶以及脂肪小叶间纤维组织保持较好，周围血管较丰富，新生脂肪细胞排列比较整齐，形态规则。实验组2对比实验组1的移植体中心区细胞分布更均匀，移植体周边区血管较丰富，纤维结缔组织较少，但以上差别不明显（图6）。

2.5 血管内皮细胞Ⅷ因子免疫组化染色

免疫组化染色显示，血管呈现棕黄色，部分毛细血管形态不规则，管腔由被染棕黄色的血管内皮细胞围成，部分微血管未见明显管腔，呈条索状或者岛状，部分只见到单个血管内皮细胞或成团簇状内皮细胞团。对照组移植脂肪组织血运不丰富，新生血管不明显。实验组1和实验组2自体脂肪移植90 d后移植体周边区和中心区血管均较丰富，但差别不明显（图7）。

2.6 毛细血管密度评估

对照组移植脂肪组织的毛细血管密度为（14.10±2.83）条/HP，实验组1为（24.85±3.27）条/HP，实验组2为（25.76±3.42）条/HP。实验组1与实验组2毛细血管密度均明显高于对照组（P＜0.05）；实验组1、2的毛细血管密度无明显差异（P＞0.05）（图8）。

图6 各组HE染色结果Fig.6Histological observation in each group by HE staining

图7 血管内皮细胞Ⅷ因子免疫组化染色结果(100×)Fig.7The samples were stained with factorⅧimmunohistochemistry method(100×)

图8 各组新生血管密度Fig.8Vessel number in each group

3 讨论

自体脂肪移植修复软组织缺损是传统方法，具有来源丰富、取材简便、组织相容性好，无排异过敏反应等优点。但自体脂肪移植存活率较低，一直是自体脂肪移植广泛应用的最大障碍。

研究认为，加快脂肪移植组织的血供重建是提高脂肪颗粒移植存活率的关键因素。CM-Dil标记的血管内皮前体细胞复合游离脂肪移植，显示了较高的脂肪存活率和新生毛细血管密度[11-12]。Langer等[16]利用活体免疫荧光显微镜进行观察，发现脂肪组织移植后的血供依赖周围血管的长入。杜学亮等[17]证明，新生血管的生长快慢对脂肪移植体尤为重要，移植体与受体建立良好的血运是脂肪移植组织存活的关键。血管内皮生长因子是最早发现的促血管生长因子，也是目前发现的最强效的促血管生成因子，在血管形成过程中发挥重要作用，局部的血管内皮生长因子（VEGF）能提高游离移植脂肪的存活率和质量[6-10]。Lei等[18]在SD大鼠自体颗粒脂肪移植的部位注射含有编码重组人血管内皮生长因子（rhVEGF）DNA的脂质体质粒，结果显示rhVEGF试验组的微血管计数远远高于对照组，脂肪移植体吸收率较低。

近年来，随着中药研究的深入开展，许多中药的药理功效得到了广泛认同。黄芪是最常用的益气中药之一，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿之功。据李时珍的《本草纲目》记载，黄芪的诸多功效皆源于其补气功能，故又有“补气诸药之最”之称。气为血之帅，气旺则血行，临床治疗气虚血瘀的病症，常配伍使用黄芪，通过益气而达活血之效。众多针对黄芪促进缺血区血管新生的相关研究认为，黄芪可明显上调VEGF水平，有促进血管内皮细胞增殖及DNA合成的作用[13-14]。雷燕等[13]应用鸡胚绒毛尿囊膜（Chorioallantoic membrance，CAM）模型和中药血清药理学方法，以CAM血管生成数量为指标观察黄芪对血管生成的影响，结果表明黄芪给药组比生理盐水对照组血管密集度增加，给药组在血管生成表现形式及血管计数方面均好于对照组，表明黄芪对血管生成有促进作用。李悦山等[15]研究同样认为黄芪有促进内皮细胞增殖和VEGF表达的作用。基于上述结果，本实验将黄芪应用在提高自体脂肪颗粒移植存活率的研究中，希望了解黄芪对自体脂肪移植组织存活率、血管新生、血运重建等的影响。

结果显示，在自体脂肪颗粒移植术后90 d，两实验组自体脂肪颗粒移植存活率均明显高于对照组，提示通过体内注射黄芪注射液有助于提高自体脂肪移植成活率。血清中VEGF表达水平检测结果显示，实验组1、2的血清VEGF在脂肪移植术后的不同时间段的表达水平均比对照组有明显增高。实验中，实验组1、2的血清VEGF浓度在术后2周达最高峰，随后逐渐下降，至术后6周仍与对照组有显著差异。提示黄芪具有持续的生物学效应，可维持6周的生物学效应，对移植脂肪存活率的提高至关重要。实验组1与实验组2的血清VEGF表达水平略有差异，但不明显。表明黄芪注射液在2.5 g/Kg.d的剂量下，已经能达到促进VEGF表达，提高脂肪移植存活率的作用。

本实验在脂肪移植术后90 d进行取材，此时移植脂肪组织的重量、体积以及组织结构基本保持稳定，HE切片染色及免疫组化染色观察显示在脂肪细胞大小、形态、坏死吸收情况、移植脂肪组织纤维化程度、新生毛细血管数量、密度等方面，实验组均优于对照组。结合自体脂肪移植术后脂肪移植组织的重量变化，以及血清内皮细胞生长因子的表达程度，我们认为黄芪可能在自体脂肪组织移植后通过加快移植体内部血供的重建，有效促进血管新生，改善组织血供及微循环，缩短自体脂肪移植组织的缺血、缺氧期，从而减轻脂肪移植组织坏死，减少组织纤维化，提高自体脂肪移植成活率。

但是，黄芪能否通过前脂肪细胞的转化，更好地提高自体脂肪组织移植的存活率，以及黄芪与其他中药如当归、丹参等的组合应用是否更有利于提高自体脂肪移植的存活率，尚待深入研究。

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（收稿日期：2013年3月20日；修回日期：2013年5月8日）

Influence of Astragalus on the Survival Rate of Fat Particle Auto-Transplantation

WU Chengxing,WANG Jian,

ZHANG Bo,ZHENG Danning,YU Li.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:YU Li(E-mail:yuoli@163. com).

ObjectiveTo explore the influence of astragalus on the survival rate of fat particle auto-transplantation. MethodsAutologous fat particle was transferred on New Zealand white rabbit to establish an animal model.The experimental groups were given different doses of astragalus by intramuscular injection.The expression level of VEGF in serum were assayed,the residual quality of the fat grafts were measured and the survival rates were calculated.After HE staining,adipocyte morphology and density of blood vessels was observed.Immunohistochemical staining of vascular endothelial cells factorⅧwere used to observe the capillary growth and density.ResultsThe survival rate of fat transplantation in experimental groups was higher than that in control group.The level of VEGF expression in experimental groups was higher than that in control group.HE staining and immunohistochemical staining of vascular endothelial cells factorⅧshowed the number,the shape,the degree of the fat transplantation fibrosis and the newborn microvessle density were better in experimental groups than that in control group.ConclusionAstragalus can significantly promote the survival rate of autologous fat particle transplantation in the model of New Zealand white rabbit.

Autologous fat transplantation;Astragalus;Vascular endothelial growth factor;Survival rate

R622+.9

A

1673－0364（2013）03－0141－05

2013年3月8日；

2013年4月20日

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

余力（E-mail：youli@163.com）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.006