应用Pre-S1 Ag诊断HBV感染的可行性研究

2013-03-01杨玉洁张绪署苏丽君邹海蛟邹林峰林雪迟

实验与检验医学 2013年1期

关键词：拷贝数乙肝抗原

杨玉洁，张绪署，苏丽君，邹海蛟，邹林峰，林雪迟

(长沙医学院医学检验系临床微生物学与免疫学教研室，湖南长沙410219)

应用Pre-S1 Ag诊断HBV感染的可行性研究

杨玉洁，张绪署，苏丽君，邹海蛟，邹林峰，林雪迟

(长沙医学院医学检验系临床微生物学与免疫学教研室，湖南长沙410219)

目的通过HBV Pre-S1抗原检测，结合乙肝HBsAg、HBeAg与HBV-DNA检测进行比较分析，研究Pre-S1抗原作为诊断乙肝患者的血清标志物的可能性。方法用ELISA检测的HBsAg、HBeAg和HBV Pre-S1抗原，采用荧光定量PCR方法检测HBV核酸。结果相对于其他模式，“大三阳”的HBV Pre-S1抗原的检出率较高(89.32%)，乙肝病毒DNA的copies也较高；在90例在HBsAg(-)、HBeAg(-)患者中，检出3例HBV Pre-S1抗原(3.33%)；恢复期的3091例患者中也检查出4例Pre-S1 Ag(＋)。结论HBV Pre-S1抗原可作为一种HBV感染血清标志物，HBsAg(－)并不能作为无HBV感染的指标，Pre-S1检测对于乙肝患者的诊断具有重大的价值。

HBV;Pre-S1抗原;HBV-DNA;荧光定量PCR;ELISA

传统上对乙肝患者诊断采用“两对半”检测，是发现乙肝患者和感染状况及抗体携带情况的主要指标，包括乙肝表面抗原(HBsAg)、表面抗体(抗-HBs)，e抗原(HBeAg)，e抗体(抗-HBe)和核心抗体(抗-HBc)。不同的组合模式代表不同临床表现，可以确定现症感染与既往感染及是否具有免疫力等。

荧光定量PCR(FQ-PCR)也称荧光实时PCR (Real-Time PCR)，FQ-PCR法检测HBV-DNA，是直接检测的HBV病毒自身，能更准确的反映乙肝病毒在体内复制和宿主的传染性情况，是乙肝血清标志物检测必要补充，用于HBV定性与定量分析，反应的是病毒的载荷。荧光PCR反应同样存在很多影响因素，包括引物、反应体系、血清抑制物、标本稳定性等，对病毒的滴度也有一定的要求存在明显的局限性[1]。

HBV前表面抗原有S区基因编码，主要分Pre-S1与Pre-S2两类。Pre-S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的最早期和乙肝的活动期，Pre-S1抗原主要用于HBV对肝细胞选择性、亲和性结合，是病毒传播、复制与增殖的前提条件，Pre-S1抗原表达水平与病毒侵袭力正相关。Pre-S2抗原，目前未在我医院临床上进行广泛开展。Pre-S1抗原性强，是临床上判断病毒是否处于高传染性的活动期的有力依据，与HBs Ag、HBeAg及HBV-DNA检测关联紧密，其独特检测价值有待进一步探索[2]。

本研究选择近五年到湖南省肿瘤医院进行乙肝病毒检查的体检人群，通过阳性乙肝患者的“两对半”与HBV-DNA荧光检测结果分析结合Pre-S1检测，探讨HBV Pre-S1抗原作为一种HBV感染患者的常规血清标志物的可能性及其潜在临床

价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器检测乙肝五项ELISA试剂盒(北京万泰公司)，Pre-S1检测试剂(上海阿尔法生物技术有限公司)，FQ-PCR试剂(上海复星生物公司)。荧光定量PCR仪(Light Cycler Roche，Switzerland)，酶标仪2S-2型(DEM-III，北京)。

1.2 检测对象近五年到湖南省肿瘤医院进行乙肝病毒体检的人群，有普通健康体检的人员与单位健康体检的人员，共7500例。其中男3652例，女3848例，年龄18～38岁。

1.3 标本的采集清晨空腹采集其静脉血5ml于真空采血管中，分离血清，离心(3500r/min,5min)，排除脂血等不合格血标本。

1.4 主要方法

1.4.1 乙肝五项ELISA检测按相关试剂盒说明，正常血清为阴性，设置对应酶标值为0。FQ-PCR检测HBV-DNA采用探针法，每次设立4个HBVDNA标准品系列浓度，1～4分别为5×107/ml、5×106/ ml、5×105/ml、5×104/ml。循环参数设定为50℃2min；93℃2min；93℃3s；60℃32s；35℃10s，43个循环；根据仪器的软件进行分析，得到各标本的HBV-DNA检测结果(基线选取6～10或6～15个循环，阈值线选在阴性对照正常扩增曲线的上方；测定值判断标准为＞1×103Copies/ml为阳性，＜1×103Copies/ml为阴性。

1.4.2 各种检测模式编号为表面抗原(HBsAg,1)、表面抗体(HBsAb,2)、e抗原(HBeAg,3)、e抗体(HBeAb, 4)、核心抗体(HBcAb,5)五种血清标志物。文中所用到的模式组合有1、3、5，1、4、5，1、5和2、4、5四种模式。

1.5 数据处理及分析用SPSS10.0建立数据库并进行分析。

2 结果

2.1 7500份标本HBsAg、HBeAg及HBV-DNA(+)的检测HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV-DNA(+)三项阳性，共1668例。其中，HBsAg(+)1127例，检出率为15.03%(1127/7500)，比例最高，提示绝大部分患者没有免疫力；HBeAg(+)259例，检出率为3.45% (259/7500)，HBV-DNA(+)282例，检出率为3.76%，部分患者处于病毒复制与增殖的活动期，感染性强。具体见表1。

2.2 Pre-S1抗原与HBsAg、HBeAg检测分析在Pre-S1(＋)192例标之中，乙肝五项主要分布于4种模式与Pre-S1抗原检测结果见表2。

表1 7500例标本HBsAg(＋)、HBeAg(＋)及HBV-DNA(+)的检出率

表2 Pre-S1Ag(＋)在乙肝筛查4种分布模式中的检出率

2.3 3350例HBV检测一项或多项阳性标本的14种模式分布及构成在乙肝五项检测中，其中五项全部为阴性的标本有4150例，有一项或多项阳性的共计3350例(包含各种抗体阳性的标本），其中男性共有1624例，女性共有1726，所具有的模式有14种，结果见表3。

2.4 Pre-S1抗原和HBV-DNA的检测对全部表面抗原阳性的标本和部分恢复期模式组的标本进行Pre-S1抗原检测和HBV-DNA检测，结果见表4。“大三阳”1、3、5模式共103例，Pre-S1(+)有92例，HBV-DNA均值为1.568E+09 IU/ml，是高拷贝数；“小三阳”1、4、5模式共81例，Pre-S1(+)有59例，HBV-DNA均值为1.267E+05 IU/ml；恢复期2、4、5，2、3、4、5，3、5模式Pre-S1(+)分别为2例、1例与1例，HBV-DNA为1.021E+03 IU/ml，拷贝数低。

2.5 Pre-S1 Ag(+)与HBV-DNA拷贝数相关性检测前8标本为“大三阳”1、3、5、模式；9～16号标本为，“小三阳”1、4、5、模式，17～24号为HBsAg(+)标本。可见表5。

3 讨论

HBsAg(＋)、HBeAg(＋)及HBV-DNA(+)的检测中，HBsAg(＋)检出率最高，提示HBsAg检测最敏感；Pre-S1Ag(＋)在乙肝筛查4种分布模式中的检出率“大三阳”高于“小三阳”，Pre-S1检出率与HBV感染进程密切相关。另外，在HBsAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)模式中也检测到3例，说明HBsAg存在一定漏检；3350份HBV检测一项或多项阳性标本的14种模式分布及构成比表明恢复

期模式2检出率最高，与绝大部分体检人群有过接种史是吻合的。本次检测的90份HBsAg(-)与HBV-DNA低拷贝数的标本中，有4份标本Pre-S1抗原阳性，证明HBsAg与HBV-DNA都有一定的漏检；这也可能与Pre-S1抗原可出现在急性乙肝感染的最早期，Pre-S1抗原性强的特点，或者乙肝病毒表面抗原具有高度变异性，逃避了常规乙肝病毒血清标志物方法的检测，相关机制有待于更深入的对其研究[3，5]。

表3 3350份HBV检测一项或多项阳性标本的14种模式分布及构成比

表4 感染期和恢复期Pre-S1和HBV-DNA的检测

另外，在HBsAg(－)样本血清中也检出了HBV-DNA与Pre-S1抗原，再次证实出现HBsAg (-)并不能作为无HBV感染的指标，存在一定程度漏检，可能与检测条件有关。龚倩在血清样本使用不同离心时间与转速条件下也发现HBsAg检出率会有差异[6]。

大部分样本Pre-S1 Ag表达与HBV-DNA拷贝数正相关，但Pre-S1 Ag表达与HBV-DNA拷贝数并不完全同步，甚至出现低HBV-DNA拷贝数，而Pre-S1 Ag高表达。这一方面可能与HBV生物学特性有关，也有可能与HBV颗粒收集过程中丢失有关[7]。

本次Pre-S1Ag(＋)检测结果中，“小三阳”Pre-S1抗原阳性检出率为72.84%(59/81)，这高于其他研究人员的报道，可能与笔者选择的人群是健康体检的群体有关[8-10]。

笔者的研究表明：“大、小三阳”标本与Pre-S1 Ag检测之间有较高的符合率，但HBsAg检出率高于Pre-S1 Ag，Pre-S1 Ag表达与HBsAg、HBVDNA检测结果并没有完全正相关联性，但HBsAg与HBV-DNA都存在一定程度的漏检，Pre-S1 Ag、HBsAg与HBV-DNA三者间可以相互之补充。HBV Pre-S1抗原可以作为一种HBV感染患者检测的常规血清标志物，对于乙肝患者的诊断具有重大的价值。

[1]钱东林.乙肝HBV-DNA荧光定量检测与血清标志物结果相关性[J].临床合理用药,2009,2(24)：13-14.

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[6]龚倩.不同离心条件对HBsAg检测结果的影响[J].免疫学杂志, 2011,27(12):1071-1073.

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Correlation analysis between HBV Pre-S1 assaying and clinical diagnosis on hepatitis B patients

YANG Yujie,ZHANG Xushu,SU Lijun,et al.Department of Clinical Microbiology and Immunology,Changsha Medical University,Changsha 410219, China

ObjectTo explore the relationship between the detection of Pre-S1 antigen and the diagnosis of hepatitis B patients.Methods ELISA was used to detect the hepatitis B virus sAg,eAg and Pre-S1 antigen.Meanwhile,Fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)was applied for HBV-DNA detection.Results Compared with other models,the model of HBsAg(+),HBeAg (+)and HBcAb(+)has the highest positive percentage of HBV Pre-S1 antigen(89.32%),which has higher hepatitis B virus DNA copies,there is a positive correlation between hepatitis B virus DNA copies and the Pre-S1 antigen.Conclusion Pre-S1 antigen of hepatitis B virus can be used as a serum marker to detect hepatitis B virus infection,HBsAg(-)is not the only feature to judge whether patients infected by HBV or not，the Pre-S1 detection has great value in diagnosing the hepatitis B patients.

HBV；Pre-S1 Ag；HBV-DNA；FQ-PCR；ELISA