改进的Coca’s液提取户尘螨过敏原蛋白的效果探究

刘小萍，王莉，吴善东

(1、萍乡市中医院检验科，江西萍乡337000；2、杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，浙江杭州310052)

改进的Coca’s液提取户尘螨过敏原蛋白的效果探究

刘小萍1，王莉1，吴善东2

(1、萍乡市中医院检验科，江西萍乡337000；2、杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，浙江杭州310052)

目的采用改进的Coca’s液提取户尘螨螨体中的蛋白，提高提取液的蛋白浓度和过敏原蛋白的效价。方法(1)细胞破碎：取样品于研钵内，液氮反复冻融4次，每次间隔10min，在研钵内反复研磨冻融后的样品。(2)蛋白提取：在离心管中加入10m l Coca’s液，4℃匀速搅拌4 h后置于4℃冰箱过夜。(3)离心：4℃，5000×g离心1h，取上清液备用。(4)测提取蛋白的浓度：Bradford Reagent法测其提取蛋白的浓度。(5)SDS-PAGE电泳：参照Tricine-SDS-PAGE配制10%分离胶和4%浓缩胶，上样10μL。(6)采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行本研究获得的提取液与进口户尘螨过敏原蛋白产品的功能性比较。结果本研究中户尘螨过敏原蛋白提取液的蛋白浓度为3.0mg/ml，远高于美国ALLERMED公司产品的0.35mg/m l；且电泳图显示包含分子量为25kDa、14kDa的户尘螨主要过敏原蛋白Der p 1、Der p 2条带，蛋白浓度也高于美国ALLERMED公司产品相应的条带；功能性实验中也表明本研究中户尘螨过敏原蛋白提取液的免疫效价也显著高于美国ALLERMED公司产品。结论可以用本研究的方法来大量提取户尘螨过敏原蛋白，提取液可替代进口产品，用作户尘螨过敏原检测试剂的生产原料或用于户尘螨过敏原皮试、点刺及脱敏治疗等，降低这些产品的生产成本，进而降低国内户尘螨过敏的诊疗费用。

尘螨；提取方法；过敏原；ELISA

过敏性疾病(变态反应疾病)被世界卫生组织(WHO)认为是当今世界性的重大卫生问题。引发过敏性疾病是由于人体吸入、食入或接触过敏原引起的，常见过敏多是I型超敏反应，而引起I型超敏反应的过敏原多为自然环境的蛋白质[1]，其中，尘螨[2，3]是最常见的过敏原之一，尘螨引起的过敏性疾病占80%左右。在人们生活的环境中，尘螨几乎无处不在，严重影响了尘螨致敏人群的生活质量。因此，尘螨过敏的诊断和治疗也变得尤为重要。除典型的临床症状之外，查找过敏原是过敏性疾病治疗和预防的关键，过敏原测定能够帮助医生确定患者出现的情况是否由过敏引起，同时确定是由何种过敏原引起的[4]。户尘螨过敏的诊断方法主要有皮肤试验和体外试验两种，皮肤试验的方法主要是点刺试验和皮内试验，体外试验即是用体外诊断试剂检测血液中的尘螨过敏原特异性抗体。脱敏治疗则是户尘螨过敏治疗手段中最常用的方法之一。上述户尘螨过敏的诊断和治疗方法中均要用到户尘螨过敏原蛋白作为免疫抗原。目前市面上质量较好的户尘螨过敏原蛋白产品主要是以美国ALLERMED公司产品、德国默克公司产品为代表的进口产品，本文采用改进的Coca’s液[5]提取户尘螨螨体中的过敏原蛋白，以期能替代进口产品。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备户尘螨螨体(美国GREER公司)。碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、EDTA、DIECA。Uinco UV-2100型紫外分光光度计。美国Bio-Rad凝胶成像系统。普朗DNM-9602酶标分析仪。改进的Coca’s液(自制)。美国ALLERMED Dust Mite Extracts(Dermatophagoides pteronyssinus 5000 AU/ m l)。

1.2 方法

1.2.1 细胞破碎取1g户尘螨螨体，放入研钵中，加入液氮使液氮液面没过样品，在液氮挥发后，将样品置于室温10min，再次加入液氮，反复冻融4次。在研钵内反复研磨冻融后的样品，时间约10min。

1.2.2 蛋白提取将研磨后的样品置于50m l离心管中，加入10ml改进的Coca’s液(0.1M Na2CO3/ NaHCO3，0.1M NaCl，2mM EDTA，20mM DIECA，pH8.2)，加入磁悬浮粒子后，在4℃条件下匀速搅拌4 h后置于4℃冰箱过夜。

1.2.3 离心取出过夜的样品，混匀后分装于两管10m l离心管中，平衡后在4℃，15000×g离心1h，取上清液备用。

1.2.4 测提取蛋白的浓度配制1ml Bradford Reagent+100μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+ 10μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+5μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+2μl蛋白上清液，其浓度分别代表原液，稀释10倍、稀释20倍、稀释50倍。在紫外分光光度计595nm测其浓度。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)参照Tricine-SDS-PAGE配制10%分离胶和4%浓缩胶。10μl样品+10μl loading buffer(2×)，混匀后加热煮沸5min，冰上冷却2min，外部加正极buffer，胶之间加负极buffer，上样10～20μl，30V至染料进入分离胶，改为90V至终点。考马斯亮蓝工作液染色30min后用脱色液脱色至背景干净。Bio-Rad凝胶成像系统进行拍照、分析。

1.2.6 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行本研究获得的提取液与进口户尘螨过敏原蛋白产品的功能性比较用本研究获得的户尘螨过敏原蛋白提取液和美国ALLERMED公司户尘螨过敏原蛋白产品以同样的浓度0.5μg/m l、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ m l分别包被酶标板，在上述包被的板孔中分别每孔加入阳性血清50μl，轻轻混匀后37℃温育45min，洗涤5次拍干，每孔加酶联结合物100μl，置37℃温育45min，洗涤5次后拍干，每孔加底物显色液100μl，37℃显色15min后加100μl终止液终止反应，使用标准酶标仪在450nm波长下，测每孔的OD值。

2 结果

2.1 户尘螨过敏原蛋白浓度本研究用改进的Coca’s液提取的户尘螨过敏原蛋白浓度为3.0 mg/ m l，而美国ALLERMED公司生产的过敏原蛋白浓度为0.35mg/ml，可见本研究所得蛋白浓度约为美国ALLERMED的9倍。

2.2 户尘螨过敏原蛋白电泳结果本研究获得的户尘螨过敏原蛋白提取液和美国ALLERMED公司的户尘螨过敏原蛋白产品的SDS-PAGE电泳结果如图1所示，可以看出两种过敏原蛋白提取液中均含有25kDa、14kDa的户尘螨主要过敏原蛋白Der p 1、Der p 2条带，且本研究获得的户尘螨过敏原蛋白提取液中的各分子量的户尘螨过敏原蛋白浓度高于美国ALLERMED公司产品。

图1 户尘螨过敏原蛋白SDS-PAGE

2.3 本研究获得的提取液与进口过敏原蛋白产品的功能性比较本研究获得的户尘螨过敏原蛋白和美国ALLERMED户尘螨过敏原蛋白以相同的浓度包被酶标板后进行同步ELISA试验，试验结果如表1所示，可见本研究的提取物效价明显高于美国ALLERMED公司产品。

表1 户尘螨过敏原提取液的功能比较

3 讨论

户尘螨过敏原蛋白提取的方法有很多[6]，例如传统的Coca’s液、PBS提取液、裂解液及Trizol试剂等。本研究利用改进的Coca’s液提取户尘螨螨体的过敏原蛋白，经与美国ALLERMED公司的户尘螨过敏原蛋白产品比较，获得的提取液蛋白浓度较高，包含户尘螨主要过敏原蛋白组分，且比购买的户尘螨过敏原蛋白效价更高，因此，可以用本研究的方法来大量提取户尘螨过敏原蛋白，提取液可替代进口产品，用作为户尘螨过敏原检测试剂的生产原料或用于户尘螨过敏原皮试、点刺及脱敏治疗等，降低这些产品的生产成本，进而降低国内户尘螨过敏的诊疗费用。

[1]于国芳,谭立明,李华,等.吸入性变应原检测对诊断过敏性疾病的临床应用[J].实验与检验医学,2012,30(3):230-232.

[2]孙劲旅,张宏誉,陈军,等.尘螨与过敏性疾病的研究进展[J].北京医学,2004,26(3):199-201.

[3]罗臣,肖小芹.尘螨引起的疾病及其防治研究进展[J].湖南中药学导报,2004,10(9):61-62.

[4]黄凯,柯江维,王晔.南昌地区儿童过敏原IgE抗体体外检测结果与分析[J].实验与检验医学,2012,30(3):291-293.

[5]Hauck PR,Williamson S.The manufacture of allergenic extracts in North America[J].Clin Rev Allergy Immunol,2001,2(1):93-110.

[6]孙劲旅,张宏誉,应万涛,等.利用双向电泳比较3种提取户尘螨蛋白的方法[J].基础医学与临床,2004,24(3):321-326.

R392.8,R593.1,R446.62

A

1674-1129(2013)05-0454-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.019

江西省萍乡市科技局资助课题(编号：萍科字2011-58)

刘小萍，女，1966年12月生，大学本科学历，学士学位，主管技师，主攻临床免疫学。