番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR检测

林 铭 胡 鸿 杜永臣 高建昌 王孝宣 国艳梅

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），病毒基因组为单链环状DNA，大小约为2.8 kb，病毒基因组含有4个ORFs（AC1、AC2、AC3和AC4）：AC1编码的Rep 蛋白在开启病毒环状DNA 的滚环复制和选择感染部位上起关键作用（Dasgupta et al.，2004；Selthet al.，2004）；AC2编码转录激活蛋白（Transcriptional activator protein，TrAP）；AC3编码与增强病毒复制相关的蛋白（Replication enhancer，REn），可以加快病毒积累，增强病毒侵染及发病能力（Elmer et al.，1988；Sunter et al.，1990；Hormuzdi & Bisaro，1995）；AC4编码的蛋白参与病毒的系统运动或症状形成。TYLCV 主要通过烟粉虱（Bemisia tabaci）传播。近年来，TYLCVD 在世界范围大面积暴发，对番茄生产造成了毁灭性危害，成为世界许多地区番茄生产的重要限制因素（Polston et al.，2002；周雪平 等，2004；何自福 等，2007；Accotto & Noris，2007；国艳梅 等，2009；张爱红 等，2011）。

对TYLCV 的检测是深入研究其致病机制以及番茄抗病育种的基础。早期，电镜是唯一鉴定该病毒的检测方法。生产上依靠观察感病番茄植株的发病症状来确定是否带毒，对无症状植株不能判断带毒与否。自TYLCV 被分离纯化后，陆续建立了血清学、分子杂交和PCR检测技术。荧光定量PCR检测法是近年来发展起来的一种灵敏快速的病毒检测方法，在病原真菌、细菌和病毒的检测中的应用已经有报道（Böhm et al.，1999）。荧光定量PCR 技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，荧光定量PCR 采用参数Ct值，C 代表循环（cycle），t 代表域值（threshold）。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。经证明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小（赵焕英和包金风，2007）。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数（陈旭 等，2010）。Mason 等（2008）采用荧光定量PCR 法对番茄植株中的TYLCV 进行定量检测，发现荧光定量PCR 法检测TYLCV 的敏感度比膜杂交高2 200倍，可以用来检测叶片中的少量病毒；Péréfarres等（2011）利用Taqman 探针法构建荧光定量PCR 方法，利用侵染克隆的方法将分别含有TYLCVMld、TYLCV-IL 和PYMV（Potato yellow mosaic virus）的侵染克隆菌液接种到番茄植株中，在接种病毒后10、20、30 d，对番茄植株的病毒含量进行检测，研究不同双生病毒的繁殖动态，发现双基因组分的PYMV 繁殖得更快，病毒含量更高。

本试验根据番茄黄化曲叶病毒基因组中AC2 的保守序列设计引物，基于SYBR Green I 检测模式，构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 绝对定量检测体系，以期为研究TYL CV 在番茄植株中的繁殖动态、病毒与番茄植株的互作等方面打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 番茄感病材料9706，为无限生长型的粉果番茄育种材料，不含任何抗TYLCV 基因，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所鲜食番茄课题组提供；含TYLCV 基因组的侵染克隆由浙江大学周雪平教授惠赠，该侵染克隆以TYLCV-IL[CN：SH2]分离物的番茄样品总DNA 为模板，获得含有1.4个重复SH2 全长基因组侵染克隆pBinPLUS-SH2-1.4A（张辉，2009），该侵染克隆含有两个EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位点，如图1所示。

BamH Ⅰ的酶切位点位于TYLCV 基因组的153位碱基处，EcoR Ⅰ的酶切位点位于TYLCV基因组的1 800位碱基处。

1.1.2 主要试剂及仪器设备 荧光定量PCR 的主要试剂：SYBR FAST qPCR Master Mix，购自北京阅微基因技术有限公司，含有实时荧光定量PCR所需的dNTP、酶及染料。

普通PCR 的主要试剂：Promega 2×GoTaq Green Master Mix，购自北京泽平科技有限责任公司，包含普通PCR所需要的dNTP、Mg2+、酶等。

进行实时荧光定量PCR 的主要仪器为罗氏荧光定量PCR 仪 LightCycler 480 Ⅱ。

图1 TYLCV-IL[CN：SH2] 侵染克隆构建流程（张辉，2009）

1.2 试验方法

1.2.1 农杆菌（含侵染克隆）的培养 取-80℃中保存的含侵染克隆的农杆菌菌株（TYLCV-SH2），在添加了卡那霉素和利福平的固体LB 培养基（Kan 50 mg·L-1+Rif 50 mg·L-1）上划平板，28℃培养2 d；菌落长出后挑单菌落于添加了卡那霉素和利福平的液体LB 培养基中（Kan 50 mg·L-1+Rif 50 mg·L-1）200 r·min-128℃培养过夜；以不加菌落的添加了卡那霉素和利福平的液体LB 培养基（Kan 50 mg·L-1+Rif 50 mg·L-1）作为对照，用分光光度计检测菌液在600 nm 波长处的吸光值，当吸光值达到0.6～0.8 之间时，该菌液可用于注射接种以及提取质粒。

1.2.2 番茄植株的准备 番茄种子用15%的次氯酸钠溶液消毒12 min，无菌水清洗3次，28℃催芽48 h，播于预先用60 目纱网覆盖的营养钵中。待植株2～4片真叶完全展开后接种病毒。接种前一天给番茄苗浇足水，接种时将长势相同的番茄幼苗分为两组，一组用一次性注射器（1 mL）吸取1 mL 菌液，去掉针头，将菌液缓慢注射在番茄叶片背面叶脉之间的叶肉处，使菌液被植株充分吸收，如图2所示；另一组作为对照，不接种。注射后适当浇水，28℃/25℃（16 h/8 h）培养，30 d 左右番茄植株会出现典型症状。整个试验期间用60 目纱网覆盖以杜绝外来病毒的感染。

图2 注射接种侵染克隆

1.2.3 DNA 提取 接种30 d后，选取发病番茄植株顶部呈黄化卷曲症状的叶片以及对照组番茄植株的相同部位叶片，用常规CTAB 法（Mason et al.，2008）提取植株总DNA。用SHIMADZU 公司的BioSpec-nano/230 v型号的微量分光光度计测定总DNA 浓度后，将其稀释为终浓度300 ng·µL-1，备用。

1.2.4 引物设计 张辉（2009）检测了我国浙江、上海、山东、江苏的感病番茄植株的TYLCV 分离物，发现均属于上海类型，并构建了含TYLCV-IL[CN：SH2]全基因组的侵染克隆。根据TYLCVIL[CN：SH2]的全基因组序列（AM282874.1），应用Primer 5.00 引物设计软件设计引物（表1）（扩增片段为基因AC2中的一段序列），由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，普通PCR 与荧光定量PCR 均采用这一对引物。

表1 TYLCV 检测所设计引物

1.2.5 荧光定量PCR 反应体系及条件 荧光定量PCR 反应体系（20 μL）：2×Master Mix 10 μL、10 μmol·L-1TySH_JC-F和TySH_JC-R各0.4 μL、DNA 1 μL、ddH2O补足20 μL。反应条件：95℃，10 min；95℃，10 s，57℃，20 s，72℃，20 s，45个循环；95℃，5 s，65℃，1 min；40℃，10 s。

1.2.6 荧光定量标准曲线制备（Mason et al.，2008） 绝对定量标准曲线制备：取适量600 nm 波长吸光值在0.6～0.8 之间的菌液，用北京博迈德生物技术有限公司的高纯度质粒小量快速提取试剂盒按试剂盒的操作说明提取质粒，作为标准样品，然后用SHIMADZU 公司的BioSpec-nano/230 v型号的微量分光光度计检测质粒浓度，用下列公式计算拷贝数，-20℃保存备用。

质粒拷贝数/μL=（C×10-9）×（6.02×1023）/（质粒碱基数×660 dalton/bp）

C表示质粒浓度，单位ng·μL-1；

每个侵染克隆含有1.4个TYLCV 全基因组，每个TYLCV 全基因组含2 781 bp。

用获得的健康番茄的DNA 溶液以10倍梯度稀释质粒，计算每个梯度所含质粒的浓度和拷贝数。然后进行荧光定量PCR，获得不同梯度与Ct值之间的关系，得到质粒浓度及拷贝数以10为底的对数与Ct值之间关系的标准曲线。

1.2.7 番茄植株中TYLCV含量的测定（Mason et al.，2008；Péréfarres et al.，2011） 根据荧光定量PCR 反应体系及条件，以稀释好的番茄总DNA 和稀释成不同梯度的质粒为模板，利用荧光定量PCR 仪进行扩增，反应完成后用最大二阶导数法对结果进行分析获得绝对定量标准曲线，然后根据样品的Ct值从标准曲线上读取样品中病毒的拷贝数，完成定量。

1.2.8 普通PCR 扩增反应体系及条件 普通PCR 反应体系（20 µL）：2×GoTaq Green Master Mix 10 µL、10 µmol·L-1TySH_JC-F 和TySH_JC-R 各0.5 µL，DNA 1 µL、ddH2O 补足20 µL。反应条件：94℃ 4 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 90 s，32个循环；72℃ 10 min。PCR 产物在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳后染色观察。

2 结果与分析

2.1 感病植株中TYLCV 绝对定量

用最大二阶导数法对7个梯度的标准样品进行绝对定量分析，计算获得标准曲线，即Ct=-3.487×log 拷贝数+43.21，效率值为1.975。本试验标准曲线见图3。

根据1.2.7 的TYLCV 的实时荧光定量PCR检测方法，测定发病番茄植株中TYLCV 的含量。结果见表2。

检测发现接种病毒的番茄植株中含有的病毒拷贝数基本相同，1 ng·μL-1的感病番茄DNA 中约含有3.47×106个病毒拷贝。

图3 实时荧光定量PCR 绝对定量标准曲线

表2 发病番茄植株中TYLCV 绝对含量

2.2 实时荧光定量PCR 与普通PCR 灵敏度比较

将获得的菌液质粒用健康番茄DNA 以10倍梯度稀释，获得若干个梯度的样品，按1.2.5及1.2.6 的方法进行实时荧光定量PCR检测及普通PCR检测，结果显示：实时荧光定量PCR能检测到106倍稀释液，最低浓度的稀释液仍可以用来计算标准曲线，如图4所示；而普通PCR 只能检测到104倍稀释液，105倍稀释液电泳条带不清晰，如图5所示。实时荧光PCR检测比普通PCR检测的灵敏度约高100倍。

图4 TYLCV 荧光定量PCR检测灵敏度

图5 TYLCV 普通PCR检测灵敏度

3 结论与讨论

本试验设计的TYLCV 特异性检测引物不仅可以用于普通PCR检测TYLCV，还可以应用于荧光定量PCR 对TYLCV 进行绝对定量检测，并且本试验通过比较普通PCR 与荧光定量PCR 的灵敏度，发现后者的灵敏度比前者高100倍，采用荧光定量PCR 方法可以检测到微量病毒。

目前国内外在TYLCV 的抗源筛选等方面做了大量工作。育种者对野生番茄的抗TYLCV 筛选结果表明，在醋栗番茄、秘鲁番茄、智利番茄、多毛番茄及契斯曼尼番茄中均存在抗病基因，抗病基因主要有Ty-1（Zamir et al.，1994）、Ty-2（Hanson et al.，2006）、Ty-3（Ji et al.，2007）、Ty-4（Ji et al.，2009）和Ty-5（Anbinder et al.，2009）。

上述抗病基因均为不完全显性基因，TYLCV 均可在含有上述基因的体内存活。尽管有研究表明TYLCV 在抗病番茄中的含量低于感病番茄（Ayed et al.，2010），但也有研究认为TYLCV含量在抗/感材料间并无绝对的差异（张辉，2009）。荧光定量PCR 的高灵敏度为准确研究病毒在不同抗性材料中的含量提供了技术可能。采用本试验所述的TYLCV 的荧光定量PCR检测方法，可以深入研究不同抗性基因的抗性机制，有助于深入研究番茄与TYLCV 之间的互作以及整合不同抗性基因来选育抗TYLCVD 的优良番茄新品种。

本试验建立了一种TYLCV含量的实时荧光定量PCR检测方法，该方法能有效检测接种病毒侵染克隆后番茄植株中病毒的绝对含量，1 ng·μL-1感病番茄中DNA 约含有3.47×106个病毒拷贝。本试验仅对接种的侵染克隆进行了定量分析，尽管所设计的引物来自于病毒基因组序列，但仍需对生产中TYLCVD 发病株进行验证，以明确其有效性。同时，进行荧光定量PCR所需的仪器及药品较为昂贵，难以普及。对病毒的简单验证可以用本试验所提供的引物序列进行。

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