肿瘤抑制基因RBM5在非小细胞肺癌组织中表达

梁 红，王 珂，张 捷

（1.长春市中心医院 呼吸内科，吉林 长春 130051；2.吉林大学第二临床医院 呼吸内科）

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其中80%～85%的病例为肺小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）。据统计，在欧洲，每年肺癌新发病例超过20万，因其死亡的人数占所有癌症相关死亡的20%。在美国，每年约有15万患者死于肺癌［1，2］。在中国大陆，肺癌的发病率和病死率均呈显著升高的趋势。尽管诊断手段，手术技术，化疗药物及化疗方法不断更新、发展，在过去的30年里肺癌的5年生存率仍然只有13%－15%［3］。吸烟是是肺癌的一个重要的危险因子，85%肺癌患者吸烟。分子学上认为非小细胞肺癌的形成缘于致癌基因的激活及抑癌基因的失活［4］。现存主要治疗方法为手术切除、放射线治疗、化学疗法，但这些疗法要受肺癌分期的限制。即使是能手术治疗的肺癌，也有半数以上的复发率。而且进展期肺癌给予含有铂剂的化疗，有效率也不过30%。生存期的中间值只有12个月。治疗方法的研发是控制肺癌的当务之急。目前正在发展以癌症临床个体化治疗为目的系统性癌分子病理阐明研究。近年用于分子靶向药物治疗效果预测的基因检测，使肺癌治疗的个体化成为可能。肿瘤的分子调控是个复杂过程，整个正常细胞网络调节过程失控会导致肿瘤发生。这过程包括细胞增殖，细胞间通信，DNA修复，染色体的稳定性，细胞运动，细胞凋亡等。RBM5基因位于3p21.3，是一些肿瘤的基因缺失的热点区域，被认为是潜在的肿瘤抑制基，RBM5基因至少编码4种不同选择转录体，在调节细胞凋亡，尤其是在调节肿瘤细胞凋亡中起到重要作用。此基因的结构、功能、肿瘤抑制机制的研究，阐明此基因可能成为未来人类肿瘤诊断、治疗的新方法。我们通过对RBM5及凋亡相关基因表达研究，以了解RBM5在非小细胞肺癌发生中的作用，以其瘤抑制基因RBM5将来成为肺癌治疗的新靶点。

1 对象与方法

1.1 组织样本的制备 原发肺癌组织及临近的非肿瘤组织：我们收集了2008年到2009年吉林大学第一及第二临床医学院的外科手术切除的非小细胞肺癌及临近非肿瘤组织作为实验样本。手术切除后快速将所需样本放入液氮中，直到蛋白被提取。详细记录被选患者的临床信息，包括性别、年龄，肿瘤病理、肿瘤临床分期使用经修订的肺癌国际分期系统。

1.2 Westeron blot方法检测 ①检测蛋白含量：蛋白裂解液提取总蛋白，然后蛋白定量。②配制15%聚丙烯酰胺凝胶。③SDS－PAGE电泳。④免疫印迹杂交（Western blot）半干式。⑤抗体孵育及显色。特异性条带的信号采用GIS凝胶成像分析系统处理 ，以各目的条带与actin光密度比值确定其含量。

2 结果

RBM5蛋白表达结果见表1，图1。在肿瘤组织中RBM5蛋白表达（P＝0.03）水平均低非肿瘤组织。在肿瘤组织中蛋白低表达率为70%（42／60）。总体上腺癌低表达率为75%（18／24），鳞癌低表达率为66.7%（24／36）。腺癌低表达率较鳞癌高，二者无统计学意义（P＝0.204）。RBM5蛋白在吸烟患者中的低表达率78.6%（33／42）高于非吸烟患者50%（9／18），有统计学意义（P＝0.005）。我们发现在NSCLC中RBM5蛋白表达缺失与淋巴结转移有关（P＝0.007）。淋巴结转移组为83.3%（25／30），无淋巴结转移组为56.7%（17／30）。与年龄及性别无关（表1）。Fas和Caspase3蛋白表达降低，Bcl－2蛋白表达增高。RBM5和Fas，Caspase3蛋白表达正相关（P＜0.05）。

表1 RBM5在60例非小细胞肺癌中表达的临床特点

图1 RBM5，caspase3，Fas，bcl－2 western在肺癌组织及癌旁正常组织中的蛋白水平的表达情况

3 讨论

RBM5是一个抑癌基因，在肾癌、乳腺癌等多种肿瘤中不同程度表达缺失。自发现以来其抑癌机制广受关注，研究发现RBM5可通过抑制凋亡，调控细胞周期循环达到抑癌作用。我们收集了临床外科手术切除的非小细胞肺癌组织及相应的非肿瘤组织，应用Westernblot方法，在蛋白水平研究RBM5基因的表达及与吸烟，病理分型、淋巴结转移的相关性分析。结果RBM5基因有70%在非小细胞肺癌组织中低表达，已有报道RBM5在乳腺癌及神经鞘瘤，及75%原发肺癌组织中表达降低［5－7］。与我们研究结果基本一致。说明RBM5在3p21.3表达的缺失是杂合子缺失，如果为纯合子缺失就不会有RBM5表达。提示RBM5表达的缺失可能是非小细胞肺癌形成的原因之一。RBM5作为抑癌基因，其如何发挥抑癌作用？以往研究显示RBM5在成人胸腺中高表达而在胎儿胸腺中低表达，提示RBM5的表达是受发育调节的。RBM5在成人胸腺中表达缺失可能导致肿瘤的发生［8］。自RBM5发现以来，其抑癌机制广为关注，研究已经证实在乳腺癌细胞CEM－C7及肺癌细胞A549中该基因可抑制细胞增生，促进细胞凋亡。RBM5通过刺激促凋亡蛋白BAX高表达，抑制抗凋亡基因 Bcl－2、Bcl－XL的表达、刺激细胞色素C向胞浆的释放以及Caspase3和9的激活途径来介导细胞凋亡过程。最新研究发现。RBM5还可通过调控Caspase2及FAS的选择性剪切来介导凋亡。RBM5抑癌作用的研究已经比较深入，但对于RBM5基因的研究多局限于细胞研究，本次我们通过对肺癌组织的研究，显示肺癌组织标本中Bcl－2表达呈上升趋势（70%，P＜0.05），RBM5，Fas和 Caspase3蛋白表达降低，与以往细胞研究结果相符。证实RBM5基因在肺癌组织中的表达缺失的存在，证实其表达缺失是非小细胞肺癌发病的重要环节，同时说明了RBM5正常表达时的抑癌作用，抑制细胞凋亡可能是其抑癌机制之一。在我们研究中RBM5表达缺失多存在于吸烟患者中。以往也有研究显示在肺癌早期患者及吸烟人群中检测出RBM5表达缺失。提示RBM5表达异常及其抗肿瘤活性与吸烟有关。另有实验证明有17个基因在实体瘤中表达降低，多与高转移率及不良预后相关。RBM5是这17个与实体瘤转移相关的基因之一。我们的实验结果显示RBM5基因表达缺失与淋巴结转移有关。所以RBM5正常表达或高表达可能会抑制肺癌的发病、发展及转移［9，10］。上述结果说明 RBM5在肺癌发病中的多样性及多效性，这可能是RBM5在不同组织类型及不同吸烟状态下表达差异的根源。该基因可能作为一复合体与其他基因相互作用。在肺癌的发病中发挥其复杂的调控功能。接下来我们将对RBM5在肺癌中表达与其他相关基因的相关性进一步研究，进一步明确RBM5在肺癌中的发生中的作用及其抑制癌机制进行研究。以期RBM5基因成为新的诊断、治疗肺癌的新方法。

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