初诊2型糖尿病患者血清中miR－29a和miR－375表达变化及其与糖、脂标志物相关性研究

梁国威，宋 燕，邵冬华，徐 旭，何美琳

（航天中心医院 检验科，北京 100049）

MicroRNA（miRNA）是一组由19－24个核苷酸组成，含有茎环结构，非编码蛋白质的小分子RNA，其主要通过与靶mRNA的3’端非编码区完全或不完全的碱基互补结合，在蛋白质翻译水平上进行调控［1－2］。目前，大量的研究显示 miRNA在心血管、感染、肿瘤以及糖尿病等疾病过程中呈现特异性的表达并起到重要作用［3－4］。

目前，在2型糖尿病（DM）患者循环血液中miRNA的变化情况已有文献报道。Zampetaki A等［5］通过基因芯片扫描和荧光定量PCR检测确证，在DM患者血循环中有13个miRNA表达异常，其中 miR－15a、miR－29b、miR－126、miR－223表达下调和miR－28－3p表达上调在2型糖尿病早期即可发生。Kong L等［6］通过文献检索选择7个miRNA，并进一步检测了它们在DM前期和新发DM患者血清中的表达水平，结果显示，miR－9、miR－29a、miR－34a、miR－146a、miR－375在新发DM患者中表达皆显著高于健康对照和糖尿病前期组。但在DM患者中，疾病相关miRNA表达变化和糖、脂标志物的相关性研究国内外未见研究报道。本研究经文献检索选择miR－375和miR－29a作为标志物，通过检测其血清中表达情况，探讨上述2个标志在初诊DM患者中表达差异，及其变化与糖、脂标志物的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组 收集2011年12月－2012年3月我院资料完整的健康体检者者，并根据体检者自述排除既往已确诊的DM的体检者，按1999年WHO的DM诊断标准，所有研究对象均行75克葡萄糖（OGTT）实验，根据空腹血糖（FPG）和2 h血糖（2 hPG）将研究对象分为糖代谢正常组和DM组。具体标准为：健康对照组：FPG＜6.1 mmol／L和2 h PG＜7.8 mmol／L；DM 组：FPG ≧ 7.0 mmol／L和／或2hPG ≧11.1 mmol／L。通过筛查共分为2组，2型糖尿病患者组（DM组）：48例，男27例，女21例，年龄35－72岁（平均54.9±9.8岁）；健康对照组：38例，男22例，女16例，年龄40－72岁（平均55.0±9.3岁）。

1.2 常规指标检测 （1）临床基本资料调查：由专人调查体检人员的身高、体重，并计算体重指数（BMI）；血压测量方法为休息15min后坐位测量右上臂肱动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP），取3次测量平均值。（2）实验室检查：空腹10 h后，使用真空采血管（美国BD公司提供）抽取空腹及服糖后2 h肘静脉血，血液离体2 h内检测完毕。采用全自动生化分析仪（AU2700，Olympus，日本）测定甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、FPG 和2h PG，试剂由日本OLYMPUS公司配套提供。糖化血红蛋白（Hb A1c）采用高效液相色谱法（HLC－73G7，Tosoh，日本）测定。

1.3 血清miRNA提取 采用mir Vana PARIS RNA试剂盒（编号AM1556，ABI公司，美国），取6 h内空腹新鲜血清400μl，严格按照试剂盒说明操作，提取100μl总RNA，RNA提取后立即－80℃保存。

1.4 miRNA相对定量检测 （1）逆转录：采用Taqman microRNA逆转录试剂盒（编号4366596，ABI公司，美国），在Gene Amp 9700 PCR仪（ABI公司，美国）上进行逆转录。反应体系15μl，包括：提取总 RNA按1∶1稀释后取5μl，100 m M d NTPs 0.15μl，MultiScribe Reverse Transcriptase 1μl，10×Reverse Transcription Buffer 1.5μl，RNase Inhibitor 0.19μl，水4.16μl，逆转录引物3 μl。反应条件为：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃ ∞，逆转录产物（c DNA）立即进行实时荧光定量PCR检测。（2）实时荧光定量PCR检测：采用7500 Real Time PCR System（ABI公司，美国），每个cDNA样本同时检测3次，循环阈值（Ct值）取3次平均值。反应体系20μl，包括：cDNA按1∶1稀释后取5μl，Taq Man Universal Master Mix II（ABI公司，美国）10μl，水4μl，引物及探针1μl。循环条件为：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40个循环。逆转录和荧光实时定量PCR检测所用引物和探针由美国ABI公司提供，编号分别是：RNU6B：001093；hsa－miR－375：000564；hsa－miR－29a：002112。

1.5 统计学处理 由于RNU6B（非编码小RNA）作为内参基因被广泛应用于miRNA研究之中［6］，本研究选择RNU6B作为内参基因。miR－29a和miR－375相对表达量以 △Ct表示，△Ct为目的基因Ct值与RNU6B Ct值的差值。采用SPSS10.0统计软件，计量资料采用±s表示，其中不符合正态分布者以中位数（25%，75%）表示，并取自然对数后进行组间比较。计量资料组间比较采用独立样本T检验，计数资料采用卡方检验。相关性检验采用Pearson相关分析。以P＜0.05做为差别有显著性的标准。

2 结果

2.1 研究对象的基本资料

DM组和对照组的FPG分别为5.1±0.5 mmol／L和8.8±1.55.1 mmol／L、2hPG 分别是6.7±0.5 mmol／L和15.4±4.3 mmol／L，Hb A1c是5.6±0.3%和8.4±1.5%，DM 组均显著高于对照组（P＜0.001）。与对照组比较，DM 组的BMI、SBP、DBP、TG、HDL－C 显 著 高 于 对 照 组 （P＜0.05）。对照组和DM 组间的性别、年龄、TC、LDLC无显著性差异（P＞0.05）。

表1 研究对象的基本资料

2.2 外周血中 miR－29a、miR－375的ΔCt值变化情况

miR－29a在对照组和DM组血清中ΔCt值分别是－9.15±1.29和10.2±1.45，DM 组血清中miR－29a表达量显著高于对照组（P＝0.001）；miR－375在对照组和DM组血清中ΔCt值分别是－5.76±1.1.67和－7.18±1.93，DM 组中的 miR－375表达量显著高于对照组（P＝0.001）。

用对照组和DM组外周血中的△Ct平均值计算差值（△△Ct值），miR－29a的△△Ct值为1.05，计算2△△ct＝2.07，即DM患者外周血中miR－29a表达量约为正常人的2.07倍，同理，miR－375的△△Ct值为1.42，DM患者外周血中miR－375表达量约为正常人的2.68倍。

2.3 血清中 miR－29a、miR－375的 ΔCt值与糖、脂检测指标相关性分析

所有研究对象（n＝86例）中的相关分析显示，miR－29a的ΔCt值与TG、TC、HDL－C、LDL－C皆无显著相关性（P＞0.05），与FPG（r＝－0.422，P＜0.001）、2hPG（r＝－0.417，P＜0.001）和 Hb A1c（r＝－0.548，P＜0.001）显著负相关，显示随FPG、2hPG和Hb A1c升高血清中miR－29a的表达量显著增加；miR－375的 ΔCt值与 TG、TC、HDL－C、LDL－C也皆无显著相关性（P＞0.05），与FPG（r＝－0.400，P＜0.001）、2hPG（r＝ －0.464，P＜0.001）和 Hb A1c（r＝－0.588，P＜0.001）也显著负相关，显示随FPG、2h PG和 Hb A1c升高血清中miR－375的表达量也显著增加。见表2。

表2 miR－29a、miR－375的ΔCt值与糖、脂检测指标相关性分析

2.4 miR－29a和miR－375的ΔCt值相关性分析

所有研究对象（n＝86例）中的相关分析显示，miR－29a和 miR－375的 ΔCt值的相关系数r＝0.828，P＜0.001，显示 miR－29a和 miR－375在 DM患者血清中表达量具有显著正相关性。

3 讨论

胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病发病的两大机制。本研究选择在初诊2型糖尿病患者血清中检测miR－29a和miR－375，是由于大量基础研究皆显示miR－29a和miR－375与胰岛β细胞分化、胰岛素表达和分泌，以及血糖水平变化和胰岛素抵抗等2型糖尿病的发生、发展的关键因素具有显著关系。

研究显示，miR－29a在血糖刺激的胰岛素分泌和胰岛素抵抗中起重要作用。He A［7］等人的研究标明，在糖尿病小鼠的骨骼肌、脂肪组织和肝脏中miR－29a表达明显上调。相反，在3T3－L1脂肪细胞中通过高表达miR－29a可显著抑制胰岛素刺激的血糖吸收，导致胰岛素抵抗的发生。最新研究显示，血糖水平变化可显著上调人和鼠的胰岛β细胞中miR－29a表达，而miR－29a表达上调可显著降低血糖刺激的胰岛素分泌。由于下调miR－29a表达可显著提高胰岛β细胞的分泌功能，提示miR－29a表达上调在糖代谢紊乱至糖尿病的发展过程起重要作用［8］。

miR－375在胰岛β细胞分化和胰岛素分泌中起重要作用。在miR－375基因敲除的小鼠模型中［9］，胰岛β细胞分化受损而减少，出现高血糖症，胰腺α细胞生成增加，糖异生和肝糖输出增加，提示miR－375在维持血糖稳态、胰岛α和β细胞生长，以及由胰岛素抵抗所致胰岛β细胞分化方面具有中重要作用。进一步研究标明［10］，在胰岛β细胞中高表达的miR－375可能通过作用于肌侵蛋白（Myotrophin）抑制血糖诱导的胰岛素分泌。相反，抑制miR－375表达可加强胰岛素分泌，显示miR－375对胰岛素的分泌有负性调节作用。而El Ouaamari A等［11］研究显示，miR－375可直接抑制3′－磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）的翻译，降低血糖刺激的胰岛素基因表达和合成，高血糖则可升高PDK1蛋白表达并同时降低miR－375表达。

尽管在组织和器官中 miR－29a和miR－375与糖代谢相关因素关系的研究已有大量文献报道，由于认识上的局限性，2008年才首次发表了血清中存在大量的 miRNA［12－13］。目前，血清中 miR－29a和miR－375表达变化与糖尿病的相互关系研究报道较少。Kong L等［6］在血清中的研究显示，与健康对照组和糖尿病前期组比较，在新诊断的2型糖尿病患者血清中 miR－29a和 miR－375表达皆显著上调。我们的研究除证实2型糖尿病患者血清中miR－29a和 miR－375皆表达上调外，miR－29a和 miR－375表达量的变化与空腹血糖、OGTT 2h血糖和Hb A1c具有显著的正相关性，提示miR－29a和miR－375在血清中表达变化有可能作为诊断2型糖尿病的分子标志物，或从治疗的角度作为2型糖尿病患者治疗新的分子靶点。

尽管有基础研究显示，miR－375可在脂肪细胞分化过程中起重要作用［14］。本研究显示，血清中miR－375表达量的变化与 TG、TC、HDL－C、LDL－C皆无显著相关性。尽管有文献报道高血糖可刺激脂肪细胞中 miR－29a的高表达［15］，但 miR－29a与脂肪细胞分化、脂肪代谢的相关性未见文献报道。本研究也证实血清miR－29a表达量与血脂各指标无显著相关性。

由于每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达［1，2］。我们研究结果显示血清中miR－29a和miR－375表达量的变化具有显著正相关性，提示miR－29a和miR－375在2型糖尿病的发生、发展中可能具有协同调控作用，其作用机理有待于进一步研究。

综上所述，本研究证实DM患者血清中的miR－29a和miR－375表达量皆显著高于对照组。血清中miR－29a和 miR－375表达量的变化与空腹血糖、OGTT 2h血糖和Hb A1c呈显著正相关，提示miR－29a和miR－375在血清中表达变化有可能作为诊断2型糖尿病的分子标志物。而血清中miR－29a和miR－375表达量的变化具有显著正相关性提示miR－29a和miR－375在2型糖尿病的发生、发展中可能具有协同调控作用。

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